巨噬細(xì)胞范文
時間：2023-03-14 21:46:06
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篇1
【關(guān)鍵詞】 巨噬細(xì)胞；視神經(jīng)再生；視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞
［Abstract］ The meaning of optic nerve regeneration is the regrowth reaction after optic nerve amputation.People has attached importance to the effect of macrophages in optic nerve regeneration.Retinal neural microglia/macrophages have multiple functions of phagocytosis and destruction，synthesis and secretion of a variety of factors which are closely related to the optic nerve regeneration environment.Injection of macrophages and macrophage conditional medium can promote the optic nerve regeneration.
［Key words］ macrophage;optic nerve regeneration;retinal neural microglia
視神經(jīng)再生是指存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell，RGC）生長出新的軸突到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特定靶位置并恢復(fù)正常功能，它包含四層含義：神經(jīng)保護、軸突延長、與靶組織再聯(lián)系、功能恢復(fù)。視神經(jīng)切斷以后的再生反應(yīng)表現(xiàn)為“芽生”通過損傷的部位到達(dá)遠(yuǎn)端的靶區(qū)。功能再生是指再生的纖維進入原來的或新的靶組織，重新建立突觸聯(lián)系，恢復(fù)失去的功能。20世紀(jì)80年代以前，人們普遍認(rèn)為哺乳動物成熟的中樞神經(jīng)細(xì)胞和周圍神經(jīng)不同，損傷后無法再生，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一部分的視神經(jīng)也不例外。直到1980年Richardson等［1］研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)哺乳動物的中樞神經(jīng)細(xì)胞能夠再生長入被埋植于大腦，脊髓或視神經(jīng)內(nèi)的周圍神經(jīng)移植物中，并經(jīng)過移植物到達(dá)靶區(qū)。這一發(fā)現(xiàn)推翻了以往的觀點，顯示了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞能夠再生，成為中樞神經(jīng)再生研究歷史上的里程碑。從此，人們對視神經(jīng)再生的可能性和條件性進行了廣泛而深入的研究。
普遍認(rèn)同的觀點是，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后內(nèi)環(huán)境的改變阻止了神經(jīng)細(xì)胞的再生。據(jù)推測［2~4］，這可能與神經(jīng)細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突細(xì)胞等受損后所引起的不適當(dāng)反應(yīng)有關(guān)，而此不當(dāng)反應(yīng)被認(rèn)為與巨噬細(xì)胞募集和增殖活化的延遲及受限所致。周圍神經(jīng)受損后往往能引發(fā)有效的巨噬細(xì)胞激活與募集，從而自發(fā)地再生。Schwartz等［5］指出其他組織恢復(fù)的原則同樣適用于CNS包括視神經(jīng)，他認(rèn)為，巨噬細(xì)胞在任何受損組織中都能發(fā)揮維持、恢復(fù)和防御的基礎(chǔ)作用，而巨噬細(xì)胞的募集（可能也包括激活）在導(dǎo)致再生的一系列事件中居于最上游的位置。在損傷的周圍神經(jīng)系統(tǒng)，再生可自然發(fā)生。其變性和再生似乎是由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)和控制的。實驗［6，7］發(fā)現(xiàn)大鼠晶狀體受損后能使視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）的存活數(shù)量增加8倍，視神經(jīng)新生軸突數(shù)增加100倍，并使得軸突生長入通常被抑制禁止的區(qū)域，其機制與神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophic factors，NTFs）無關(guān)，而與激活的巨噬細(xì)胞有關(guān)。晶狀體受損能刺激巨噬細(xì)胞激活和聚集，且在晶狀體未受損時注射能激活巨噬細(xì)胞酵母聚糖A（Zymosan A）也促進了RGC軸突再生并長入遠(yuǎn)處視神經(jīng)斷端。因此，巨噬細(xì)胞在視神經(jīng)再生中的作用開始受到人們的重視，巨噬細(xì)胞激活與聚集很可能是神經(jīng)再生的關(guān)鍵步驟之一，對再生和成長支持的許多繼發(fā)步驟有重大的作用。
1 巨噬細(xì)胞的起源和視網(wǎng)膜中的分布
1.1 起源 早在19世紀(jì)末俄國人Metchnikoff就觀察到從海星幼體中胚層分離的一種具有阿米巴變形運動特點的細(xì)胞能夠?qū)㈩w粒性異物吞入細(xì)胞內(nèi)，因此提出了吞噬（phagocytosis）這個概念，至20世紀(jì)70年代Van Furth以單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（mononuclear phagocytic systen，MPS）這一概念取代了網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，而單核/巨噬細(xì)胞則是MPS的基本組成部分。單核/巨噬細(xì)胞是骨髓造血干細(xì)胞發(fā)育分化而來，在骨髓中經(jīng)歷多能干細(xì)胞-定向干細(xì)胞（髓樣干細(xì)胞）-單核母細(xì)胞（monoblast）-前單核細(xì)胞（promonocyte）-單核細(xì)胞的發(fā)育過程。骨髓中的單核細(xì)胞成熟后進入外周血，血腫的單核細(xì)胞穿過學(xué)館內(nèi)皮細(xì)胞間隙進入組織則進一步發(fā)育分化為巨噬細(xì)胞，廣泛分布于全身所有表皮和黏膜下組織，在防御感染，自身穩(wěn)定和免疫監(jiān)視中都起著重要作用，可抵抗細(xì)菌、真菌和病毒等病原體的感染以及清除凋亡細(xì)胞和突變細(xì)胞。
1.2 分布 巨噬細(xì)胞廣泛分布于機體內(nèi)，包括干的Kupffer細(xì)胞、結(jié)締組織的巨噬細(xì)胞、肺的塵細(xì)胞、骨組織的破骨細(xì)胞及表皮的Langerhans細(xì)胞等。目前許多證據(jù)［8］表明小膠質(zhì)細(xì)胞可能是從血液中單核細(xì)胞或多能單核前體細(xì)胞演變而來，是分布于神經(jīng)組織包括視神經(jīng)內(nèi)的屬于神經(jīng)系統(tǒng)游走巨噬細(xì)胞中的一群。
視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞有兩種類型：基質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞和血管周圍小膠質(zhì)細(xì)胞。前者是在哺乳動物胚胎約第10周由血液單核細(xì)胞或其前體經(jīng)睫狀體扁平部進入視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)變而成，表面標(biāo)志為CD45，MHCⅠ，MHCⅡ；后者是小膠質(zhì)細(xì)胞在胚胎第14周從視神經(jīng)進駐視網(wǎng)膜后在血管周圍形成，具有巨噬細(xì)胞表面抗原S22，CD68［9］。
2 巨噬細(xì)胞在視神經(jīng)再生中的功能和作用
視神經(jīng)再生的困難很多，主要有三個:（1）視神經(jīng)橫斷傷后RGC會死亡。將成年大鼠的視神經(jīng)在近眼球處橫斷，1周后RGC死亡50%，在1個月末時則達(dá)90%。（2）大部分成熟的橫斷后的RGC不會程序性地再開始軸突延長。（3）視神經(jīng)內(nèi)環(huán)境中的很多因子在橫斷傷后表達(dá)增加，對軸突生長起抑制作用;而且，許多營養(yǎng)因子缺乏也使軸突難以生長。因此，在神經(jīng)保護使RGC存活的前提下，視神經(jīng)再生的研究集中于制造一個適合的環(huán)境，主要有三方面［10］:（1）移除髓鞘及其產(chǎn)物如髓鞘相關(guān)糖蛋白等對軸突再生的抑制作用。（2）提供額外的神經(jīng)營養(yǎng)因子，如:腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophin factor，BDNF），神經(jīng)營養(yǎng)因子4/5（neurotrophin-4/5，NT-4/5），睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF），酸性成纖維細(xì)胞生長因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）等。（3）促進軸突內(nèi)在的生長潛能。
像所有吞噬細(xì)胞一樣，視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞具有吞噬和殺傷，合成和分泌多種活性因子等主要功能。而這些功能無一不與營造上述適合視神經(jīng)再生的內(nèi)環(huán)境有密切關(guān)系。
2.1 巨噬細(xì)胞的主要功能
2.1.1 吞噬功能 小膠質(zhì)細(xì)胞在正常視網(wǎng)膜內(nèi)一般處于靜止?fàn)顟B(tài)，此時其氧耗量比較低，表面MHC-Ⅱ類分子水平較低，很少甚至不分泌細(xì)胞因子。在損傷早期小膠質(zhì)細(xì)胞即被微小的病理變化所激活后，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥時小膠質(zhì)細(xì)胞接受損傷信號刺激后立即以較快的速度向損傷部位遷移，并附著于受損神經(jīng)元表面。若損傷輕微易修復(fù)則小膠質(zhì)細(xì)胞不轉(zhuǎn)變?yōu)橥淌尚?；若損傷嚴(yán)重則小膠質(zhì)細(xì)胞將轉(zhuǎn)變?yōu)橥淌杉?xì)胞行使吞噬功能［11］。部分小膠質(zhì)細(xì)胞在貼近受損神經(jīng)細(xì)胞后會處于一種介于靜止和激活之間的中間狀態(tài)，它們會很快增殖，消化和降解微小生物，死亡的細(xì)胞及其他組織碎片，促進組織修復(fù)［12］。
視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橥淌尚秃竽芡淌汕柿字?3］包括MAG，并將其分解后進入脂質(zhì)降解產(chǎn)物的循環(huán)［14］。CNS髓磷脂是髓鞘的化學(xué)成分，是由成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的質(zhì)膜生長形成的，未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞無形成髓鞘的能力，發(fā)育過程中其在阻止神經(jīng)發(fā)芽及穩(wěn)定視通路的神經(jīng)纖維軸突數(shù)中起了一定作用。用X線照射或用有絲分裂抑制劑有效抑制新生大鼠脊髓內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生和形成髓鞘，則大鼠損傷后視神經(jīng)可獲成功再生［15］。體外實驗證實髓磷脂連接蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG）也具抑制神經(jīng)細(xì)胞軸突生長的作用。MAG是含量很高的一種髓磷脂蛋白。1994年，Mclerracher等指出在試管內(nèi)MAG能抑制神經(jīng)突生長。Eric等［16］用擠壓后的15d雞胚的視網(wǎng)膜-視神經(jīng)移植物做實驗。采用CALI法消除MAG的作用，使視網(wǎng)膜軸突明顯再生越過了包含CNS髓磷脂的損傷區(qū)。電子顯微鏡觀察到神經(jīng)橫斷處有大量再生軸突越過斷端裂口。在神經(jīng)殘端用衰退性標(biāo)記橫斷的視神經(jīng)，未發(fā)現(xiàn)有被標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)元，與未被切斷的神經(jīng)幾乎毫無區(qū)別。這些結(jié)果表明CNM是一種重要的髓磷脂源性神經(jīng)再生抑制成分。除去MAG作用可顯著促軸突生長越過CNS損傷區(qū)。視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞可能是通過吞噬鞘磷脂包括MAG來促進軸突生長。
2.1.2 分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子 大量研究證實補充神經(jīng)營養(yǎng)因子能改善神經(jīng)再生的微環(huán)境，使視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞避免損傷或死亡，促進神經(jīng)再生及功能恢復(fù)。體外研究揭示，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞可分泌生長因子如堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF），神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（neurotropM 3，NT-3）、轉(zhuǎn)移生長因子（transfroming growth factor，TGF）等。Batchelor等［17］在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞能表達(dá)BDNF和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。體外研究［18］表明，巨噬細(xì)胞分泌的物質(zhì)有促進纖維增生和血管再生功能，然而未激活的巨噬細(xì)胞上清液并沒有這種功能。激活的巨噬細(xì)胞可分泌100多種蛋白質(zhì)分子，其生物活性影響到細(xì)胞生長與死亡以及免疫炎癥反應(yīng)的每一個方面。其分泌血小板衍生生長因子（PDGF），表皮生長因子（EGF），和胰島素樣生長因子（IGF-I）等能促進視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）增生［20］。Chamak等［21］發(fā)現(xiàn)鼠腦損傷早期會出現(xiàn)凝血酶致敏蛋白（一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白）的積聚。它是由腦巨噬細(xì)胞合成和分泌的。從胚胎鼠腦分離的巨噬細(xì)胞可促進培養(yǎng)的CNS神經(jīng)元的神經(jīng)軸突生長和再生，這種作用可被凝血酶致敏蛋白抗體所抑制。他們認(rèn)為，在發(fā)育或在病理情況下，巨噬細(xì)胞有助于軸突的生長或再生。Lotan等［22］發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)損傷后TNF和集落刺激因子1能明顯增加侵入視神經(jīng)的巨噬細(xì)胞的數(shù)量，而且TNF-α可改變視神經(jīng)黏附神經(jīng)元的性質(zhì)，增強培養(yǎng)的PCJ 2細(xì)胞在其上的黏附。而這種神經(jīng)元的黏附與軸突的再生能力相關(guān)。這些結(jié)果提示。在CNS損傷部位增加激活的巨噬細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量可能有助于增強一些有利于生長的神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)（如層粘連蛋白、凝血酶致敏蛋白）的分泌，提供一個有益于促進軸突再生的環(huán)境。Lin等［23］通過體內(nèi)體外實驗均發(fā)現(xiàn)在大鼠視神經(jīng)損傷處聚集的巨噬細(xì)胞能分泌編碼EphB3的mRNA并表達(dá)可組成EphB的蛋白分子，而EphB分子能提高大鼠視神經(jīng)的再生功能。
2.2 巨噬細(xì)胞抑制因子 一些研究已指出與身體內(nèi)的其他組織相比（包括周圍神經(jīng)），中樞神經(jīng)受損后，巨噬細(xì)胞的募集功能受限，表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞的缺乏和活性的抑制。事實上，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在一個抑制巨噬細(xì)胞募集和激活的因子，而這可能是中樞神經(jīng)不能再生的一個因素［24~27］，我們稱之為內(nèi)在的巨噬細(xì)胞抑制因子［28］。在正常視神經(jīng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)阿樸脂蛋白E，在視神經(jīng)橫斷后1周星形膠質(zhì)細(xì)胞的阿樸脂蛋白E表達(dá)減少，而且侵入的巨噬細(xì)胞很少，可能的原因就是因為存在這種可溶性巨噬細(xì)胞抑制因子［29］。
2.3 與雪旺細(xì)胞的相互作用 神經(jīng)生長因子（NGF）是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，是參與損傷神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的重要因素。如果能提高神經(jīng)損傷后局部合成、分泌NGF的水平，必將有利于神經(jīng)再生。神經(jīng)損傷后局部趨化的巨噬細(xì)胞能促進雪旺細(xì)胞分泌NGF，Heumann等［30］發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷后在體內(nèi)試驗中出現(xiàn)了NGF及NGFR-mRNA水平不同程度的增加，但在培養(yǎng)坐骨神經(jīng)段則僅出現(xiàn)了NGFR-mRNA水平的增加，未出現(xiàn)NGF mttNA增加，但當(dāng)在培養(yǎng)基中加入激活的巨噬細(xì)胞或應(yīng)用巨噬細(xì)胞調(diào)理液進行培養(yǎng)時，NGFmRNA出現(xiàn)了類似于體內(nèi)的增加合成，這提示NGF-mRNA在雪旺細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)增加是由巨噬細(xì)胞分泌的某種因子來進行調(diào)節(jié)的。Lindlaolm等［31］在培養(yǎng)基中加入白細(xì)胞介素-1（Interleukin-1，IL-1），得到了與加入激活巨噬細(xì)胞相同的結(jié)果，而巨噬細(xì)胞可以分泌IL-1，所以神經(jīng)損傷后局部NGF的合成增加是由巨噬細(xì)胞分泌IL-1作用于雪旺細(xì)胞，從而引起NGF-mRNA增加合成并進行翻譯而完成的。近年來研究發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)雪旺細(xì)胞中加入轉(zhuǎn)移生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF- β1），結(jié)果NGF和NGFR-mRNA的水平均明顯下降，并能激發(fā)雪旺細(xì)胞增生。巨噬細(xì)胞能合成和分泌TGF-β1，說明巨噬細(xì)胞除可對NGR-mRNA進行上調(diào)外，還可通過分泌TGF-β1對NcFmRNA進行下調(diào)，這進一步說明巨噬細(xì)胞對神經(jīng)再生具有重要影響。
3 注射巨噬細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞調(diào)理液
3.1 注射巨噬細(xì)胞 Schwartz［32~33］研究小組的一系列研究提示移植激活的自體巨噬細(xì)胞可有助于克服CNS再生障礙，促進軸突的再生，有利于脊髓功能的改善和視神經(jīng)的再生。血管的形成和雪旺氏細(xì)胞的滲入也更明顯，這使層粘連蛋白增高，為軸突再生提供了一個合適的基質(zhì)。Lazarov等［34］通過實驗證實在橫斷處植入活化的巨噬細(xì)胞可促進RGC軸突長入遠(yuǎn)端的視神經(jīng)，他們切斷視神經(jīng)，但保留血供和神經(jīng)鞘的完整，巨噬細(xì)胞在體外孵育時用坐骨神經(jīng)碎片活化后以混懸液植入橫斷處，7~8周后4Di-10ASP逆行標(biāo)記發(fā)現(xiàn)有軸突再生。Yuqin等［35］將雄性大鼠在視處鉗壓2 mm，5 s后制成視神經(jīng)損傷模型。在其傷眼內(nèi)損傷當(dāng)日（A組）和3天后（B組）分別注射安慰劑PBS（n=4/每組）作為對照組，實驗組在實驗前7天（a組）和3天（b組），損傷當(dāng)日（c組）和損傷后3天（d組），7天（e組）分別都注射酵母聚糖A（n=4/組）。提前7天注射酵母聚糖即可使局噬細(xì)胞水平大量增高并維持一至兩個禮拜，而a組和b組未見能明顯改善視神經(jīng)再生水平，c組，d組平均能使受損側(cè)神經(jīng)生長4.7 mm，是a，b組的2倍，這提示并非巨噬細(xì)胞的數(shù)量決定了RGCs能否被刺激產(chǎn)生新的軸突和程度。d組是c組提高神經(jīng)軸突再生水平的1.6倍（P=0.06），是B組的9倍（P
3.2 巨噬細(xì)胞調(diào)理液（macrophage conditional medium，MCM） 將生后2~3天Swagae-Dawley大鼠視網(wǎng)膜組織經(jīng)胰蛋白酶消化后進行培養(yǎng)，并設(shè)對照組。結(jié)果培養(yǎng)在鼠尾膠原上的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞（retinal Neurol，RN）生長良好，且部分細(xì)胞伸出突起培養(yǎng)1、3、5天，MCM促RN存活率分別為40.7％、39.9％和51.2％。故認(rèn)為MCM能明顯促進培養(yǎng)RN的存活和生長，表明MCM中存在某些促進RN存活的營養(yǎng)物質(zhì)［37］。
4 展望
一些動物實驗在一定程度上說明了適度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞有利于CNS損傷后結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的功能將是未來應(yīng)用小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞作為一種治療視神經(jīng)損傷手段的方向。
參考文獻(xiàn)
1 Richardson PM，McGuinness UM，Aguayo AJ.Axons from CNS neurons regenerate into PNS grafts.Nature，1980，284（5753）：264-265.
2 David S，Auayo AI.Axonal elongation into peripheral nervous system bridges after central nervous system injury in adult rats.Science，1981，214:931-933.
3 Schnell L，Schwab ME.Axonal regeneration in the rat spinal cord produced by an antibody against myelin-associated neurite growth inhibitors.Nature，1990，343:269-272.
4 Cadelli DS，Bandtlow CE，Schwab M.Oligodendrocytes and myelin-associated inhibitors of neurite outgrowth：their involvement in the lack of CNS regeneration.Lip Neurol，1992，15:189-192.
5 Schwart M，Lazarov SO，Rapalino O，et al.Potential repair of rat spinal cord injuries using stimulated homologous macrophages.Neurosurgery，1999，44：1041-1046.
6 Steven Leon，Yuqin Yin，Jennifer Nguyen，et al.Lens Injury Stimulat es Axon Regeneration in the Mature Rat Optic Nerve.The Journal of Neuroscience，2000，20（12）：4615-4626.
7 Cai D，Qiu J，Cao Z，et al.Neuronalcyclic AMP controls thedevelopment loss sinability of axons to regenerate.Neurosci，2001，21：4731-4739.
8 Navascues J，Moujahid A，Almendos A，et al.Origin of microglia in the quail retina:central-to-peripheral and vitreal-to-scleral migration of microglial precursors during development.Comp Neurol，1995，354：209-228.
9 Diaz-Araya CM，Provis JM，Penfold PL，et al.Development of microglial topography in human retina.J Comp，1995，363：53-68.
10 Chierzi S，F(xiàn)awcett JW.Regeneration in the mammalian optic nerve.Restor Neurol Neurosci，2001，19：109-118.
11 Kreutzberg GW，Microglia.A sensor for pathological events in the CNS.Trends Neurosci，1996，19：312-318.
12 Chen A，Kumar SM，Sahley CL，et al.Nitric oxide influences injury-induced microglial migration and accumulation in the leech CNS.J Neurosci，2000，20：1036-1043.
13 Lazarov SO，Solomon AS，Zeev BAB，et al.Transplantation of activated macrophages overcomes central nervous system regrowth failure.FASEB J，1996，10（11）：1296-1302.
14 Lazarov-Spiegler，AS Solomon，AB Zeev-Brann，et al.Transplantation of activated macrophages overcomes central nervous system regrowth failure.The FASEB Journal，1996，10：1296-1302.
15 Faber-Elman A， Solomon A， Abraham JA， et al.Involvement of wound-associated factor in rat brain astrocyte migratory response to axonal injury:in vitro simulation.J Clin Invest，1996，97（1）：162-171.
16 Wong Ev，David S，Jacob MH，Jay DG.Inactivation of myelin-associate glycoprotein enhances optic nerve regeneration.J Neurosci，2003，23（8）：3112-3117.
17 Batchelor PE，Liberatore GI，Wong JY，et al.Activated macrophages and microglia induce dopaminergic sprouting in the injured striatum and express brain-derived neurotrophic factor and glial cell line derived neurotrophic factor.J Neurosci，1999，19（5）：1708-1716.
18 張慶軍，王廣慶，陳玉柱.巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性物質(zhì)在創(chuàng)面愈合過程中的作用.中華整形燒傷科雜志，1997，13（6）：454-456.
19 馬向陽，于涯濤.巨噬細(xì)胞與雪旺細(xì)胞在周圍神經(jīng)再生中的相互調(diào)控.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，1995，11（4）：383-388.
20 Takagi H，Yoshimara N，Tanihara H，et al.Insulin-like growthfactor-related genesreceptors and blinding proteins in cultured human retina pigment epithelical cells.Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35（3）：916-923.
21 Chamak B，Morandi V，Maltat M.Brain macrophages stimulate neurite growth and regeneration by secreting thrombospondin.J Neurosci Res，1994，38（2）：221-233.
22 Lotan M，Omon A，Ben Bassat S，et al.Cytokines modulate the inflammatory response and change permissiveness to neuronaadhesion in injured nlamma兒an central nervrous system.Exp Neurol，1994，126（2）：284-290.
23 Liu X，Hawkes E，Ishimaru T，et al.EphB3：an endogenous mediator of adult axonal plasticity and regrowth after CNS injury.J Neurosci，2006，26（12）：3087-3101.
24 Schwart M，Lazarov SO，RapaIino O，et al.Potential Repair of rat spinal cord injuries using stimulated homologous macrophages.Neurosurgery，1999，44：1041-1046.
25 Hirschberg DL，Schwartz M.Macrophage recruitment toacutely injured central nervous system is inhibited by a resident factor：a basis for an immune-brain barrier.J Neuroimmunol，1995，61（1）：89-96.
26 Lazrov SO，Solomon AS，Zeev BAB，et al.Transpantatlon of activated macrophages overcomes central nervous system regrowth failure1.FASEB J，1996，10（11）：1296-1302.
27 Lazarov SO，Solomon AS，Sehwartz M.Link between optic nerve regrowth failure and macrophage stimulalion in mammals.J Vision Res，1999，39（1）：169-175.
28 Hirschberg DL，Schwartz M.Macrophage recruitment to acutely injured central nervous system is inhibited by a resident factor：a basis for an immune-brain barrier.Neuroimmwzol，1995，61：89-96.
29 Heiduschka P，Thanos S.Restoration of the retinofugal pathway.Prog Retin Eye Res，2000，19：577-606.
30 Heumann R，Lindholm D，Bandtlow C，et al.Differential regulation of mRNA encoding nerve growth factor and its receptor in rat sciatic nerve during development，degeneration，and regeneration：role of macrophages.Proc Natl Acad Sci USA，1987，84（23）：8735-8739.
31 馬向陽，于涯濤.巨噬細(xì)胞與雪旺細(xì)胞在周圍神經(jīng)再生中的相互調(diào)控.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，1995，11（4）：383-388.
32 Schwart M，Lazarov SO，Rapalino O，et al.Potential repair of rat spinal cord injuries using stimulated homologous macrophages.Neurosurgery，1999，44：1041-1046.
33 George R，Griffin Jw De.Layed macrophage responses and myelin clearance during Wallerian degeneration in the central nervous system：the dorsal radleulotomy model.Exp Neuro1，1994，129（2）：225-236.
34 Lazarov-Spieglero O，Solomon As，Schartz M.Peripheral nerve stimulated macrophages simulate a peripheral nerve-like regenerative response in rat transected optic nerve.Glia，1998，24：329-337.
35 Yuqin，Yin Qi，Cui Yiming，et al.Macrophage-Derived Factors Stimulate Optic Nerve Regeneration.The Journal of Neuroscience，2003，23 （6）：2284.
篇2
【關(guān)鍵詞】巨噬細(xì)胞；小鼠；吞噬功能；檢測方法
細(xì)胞吞噬作用最早是單細(xì)胞動物攝取營養(yǎng)物質(zhì)的方式，也是原始防御作用。通過對小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活動的觀察，可使學(xué)生加深理解細(xì)胞吞噬作用的過程及意義。本項目通過改用酵母菌作為吞噬顆粒，希望可以得到更全面、直觀、生動的巨噬細(xì)胞吞噬觀測效果。同時，改用體外吞噬法來檢測巨噬細(xì)胞的吞噬功能，使實驗更加簡便、易行、經(jīng)濟。通過以上優(yōu)化及改進，旨在探討建立一種更為經(jīng)濟，簡便直觀的觀察小鼠巨噬細(xì)胞吞噬效果的實驗改良法。
一、材料
1．小白鼠腹腔注射液
6%淀粉肉湯。在100mL蒸餾水中加入牛肉膏0.3g，蛋白棟1g，氯化鈉0.5g，加熱后加入可溶性淀粉6g，促使溶解后煮沸滅菌，置4℃冰箱保存。用時水溶融化即可。
2．吞噬物
酵母菌菌液。將酵母菌接種于麥汁斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24小時后，用生理鹽水反復(fù)吹打沖洗斜面培養(yǎng)基上的酵母菌，離心收集菌體，制成菌懸液后加熱殺死菌體。用1％美藍(lán)染色，反復(fù)生理鹽水洗滌離心3次后，制成菌懸液，可長期4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
二、方法
在實驗前一天，給小白鼠腹腔注射6%淀粉肉湯1mL/只，輕按小白鼠腹部，使懸液分散。24h后將注射過淀粉肉湯的小白鼠腹腔注射10億/mL的酵母菌菌液1mL/只，頸椎脫臼法處死小鼠，用注射器從小鼠腹腔吸出腹腔液。在eppendorf管中各加入巨噬細(xì)胞懸液和酵母菌菌液各300µL，置37℃溫箱保溫20min。用滴管吸取混合液滴片，加蓋玻片后直接用高倍鏡觀察，并隨時滴片繼續(xù)觀察不同時期的吞噬狀態(tài)。
三、效果
本實驗與常規(guī)體內(nèi)吞噬雞紅細(xì)胞法相比，具有以下特點：①改選酵母菌作為吞噬顆粒來觀察巨噬細(xì)胞的吞噬效果。酵母菌體積極較小，與雞紅細(xì)胞相比更易被巨噬細(xì)胞吞噬，因此在有限的實驗時間內(nèi)更易觀察到吞噬現(xiàn)象的三種階段，吞噬現(xiàn)象觀察更為生動全面。酵母菌還可預(yù)先被染色，與其它細(xì)胞區(qū)分明顯，在顯微鏡下有更加直觀、生動的觀察，在室溫適宜時，還可作吞噬過程的連續(xù)攝影，增加了實驗的直觀性。另外，酵母菌可長期保存，活化方法簡易可行，較血細(xì)胞而言大大節(jié)省了實驗費用；②改用直觀簡便的體外eppendorf管法來達(dá)到實驗效果。在此法中，巨噬細(xì)胞和酵母菌各取適量于eppendorf管中，兩者完全處于自由懸浮狀態(tài)，有充分的接觸機會，比在體內(nèi)注入酵母菌更易全面接觸，所以檢測的吞噬指數(shù)更高，觀察更為清晰直接。還可避免學(xué)生在注射雞紅細(xì)胞時常因注射部位的偏差，吸取腹腔液觀察時常有雞紅細(xì)胞量過少的等問題出現(xiàn)，導(dǎo)致實驗結(jié)果觀察失敗。③優(yōu)化后實驗可與動物免疫血清制備及其檢測的實驗相結(jié)合，使得老鼠實驗成本大為降低，從而更加經(jīng)濟?？傊?，希望采用這種方法后，使巨噬細(xì)胞吞噬實驗變得操作簡單，易于掌握，費用降低，觀察時清晰可辨，以達(dá)到較好的教學(xué)效果。
作者簡介：
篇3
關(guān)鍵詞：SRT1720 動脈粥樣硬化 泡沫化程度 氧化低密度脂蛋白
Experimental Study on the Optimal Administration Time of SRT1720 in Inhibiting the Foaming of Macrophages
JIANG Yi-hua WANG Qian CAI Jin-yu LYU Xue-yang WANG Qi ZHOU Xiao LI Jing-jing
School of Medical Imaging,Xuzhou Medical University;
Abstract：Objective To investigate the relationship between the suppression of macrophage foaming by SRT1720 and the administration time.Methods Macrophage RAW264.7 was planted on three 24 well cell culture plates. Each plate was divided into three groups to culture cells. Control group only added medium and oxLDL group added 60 μ g/ml ox-LDL, ox-LDL + srt1720 group, 60 μg/ml ox-LDL, cultured for different times(0,12, 24 h) and then added 10 μmol/L SRT1720 intervention, oil red O staining and cholesterol determination, compared macrophage foam inhibition situation. Results Compared with the control group, the cholesterol content in ox-LDL group increased at 0, 12 and 24 hours, the difference was statistically significant(P <0.05); Compared with ox-LDL group, the ratio of oil red O staining at 0 and 12 hours in ox-LDL + SRT1720 group decreased, the difference was statistically significant(P<0.05), and the ratio of oil red staining at 24 hours decreased slightly, but the difference was not statistically significant(P>0.05); The cholesterol content in ox-LDL + SRT1720 group decreased at 0 h, the difference was statistically significant(P <0.05), and decreased slightly at 12 and 24 h, but the difference was not statistically significant(P >0.05).Conclusion SRT1720 has a better inhibitory effect when administered in the early stage of atherosclerosis.
Keyword：SRT1720; Atherosclerosis; Degree of foaming; Oxidized low-density lipoprotein;
巨噬細(xì)胞泡沫化（macrophage foam）是動脈粥樣硬化的重要因素，脂質(zhì)的過量存積則是泡沫化的主要原因，減少細(xì)胞內(nèi)己經(jīng)存積的脂質(zhì)對抑制泡沫化有重要作用[1-3]。去乙?；?(SIRT1）通過減少泡沫細(xì)胞的形成阻止動脈粥樣硬化[4-6]，使肝X受體（LXR）去乙酰化后可以上調(diào)后者的活性，促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運將膽固醇從細(xì)胞內(nèi)排出，通過抑制早衰防止內(nèi)皮功能紊亂。已證實SIRT1在巨噬細(xì)胞中可以降低動脈粥樣硬化的發(fā)生。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1通過抑制NF-k B信號通路[7]降低凝集素樣ox-LDL受體-1(Lox-1）的表達(dá)，從而降低氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的攝取[8,9]。SIRT1在穩(wěn)定斑塊、降低膽固醇攝取、抑制巨噬細(xì)胞泡沫化以及減輕炎癥反應(yīng)等方面的積極作用，使其成為防治動脈粥樣硬化的新靶標(biāo)。SRT1720是人工合成的SIRT1特異性激活劑，SRT1720通過與氨基末端催化區(qū)的變構(gòu)位點結(jié)合，連接到SIRT1酶-肽底物復(fù)合物上，降低乙?；孜锏拿资铣?shù)值，從而激活SIRT1[10-13]。已有研究表明[14],SRT1720可以抑制巨噬細(xì)胞泡沫化，但是對于SRT1720的干預(yù)時間對巨噬細(xì)胞的泡沫化的抑制效果的影響報道罕見，本研究分別在巨噬細(xì)胞經(jīng)ox-LDL干預(yù)不同時間后加入SRT1720，觀察SRT1720的干預(yù)時間對治療效果的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及材料
小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海），氧化低密度脂蛋白ox-LDL購于上海源葉生物科技有限公司（上海），SIRT1激活劑SRT1720購于大連美倫生物科技有限公司（大連），油紅O購于上海索橋生物科技有限公司（上海），總膽固醇測試盒購于南京建成生物工程研究所（南京）。
1.2 方法
將巨噬細(xì)胞RAW264.7種植于3個24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個培養(yǎng)板分3組培養(yǎng)細(xì)胞，Control組只加培養(yǎng)基，ox-LDL組加60μg/ml ox-LDL,oxLDL+SRT1720組先加60μg/ml ox-LDL，分別培養(yǎng)不同時間（0、12、24 h）后再加入10μmol/L SRT1720干預(yù)，采用油紅O染色和膽固醇測定，比較巨噬細(xì)胞泡沫化抑制情況。
1.2.1 油紅O染色
細(xì)胞培養(yǎng)終止后，去掉原細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，5 min/次；用4%多聚甲醛室溫下固定15 min，固定結(jié)束后PBS漂洗5 min×2次；取油紅O儲備液6 ml，加入蒸餾水4 ml配成油紅O工作液，混合后靜置10 min，濾紙避光過濾后配成油紅O工作液，每孔加入油紅O工作液200μl，避光染色40 min；蒸餾水洗10 s×2次，光鏡下觀察并拍照。
1.2.2 膽固醇含量測定
細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束，光鏡下帶200μm標(biāo)尺拍照，隨機取10個細(xì)胞，通過細(xì)胞與標(biāo)尺的比例關(guān)系計算平均細(xì)胞直徑，細(xì)胞密度取水的密度，由球體體積計算公式和細(xì)胞質(zhì)量計算公式算出細(xì)胞質(zhì)量；對細(xì)胞進行消化分離，制備細(xì)胞懸液并取出，1000 r/min，離心10 min，棄上清液，留細(xì)胞沉淀；用PBS清洗2次，取少量細(xì)胞懸液計數(shù)，計算每孔的細(xì)胞數(shù)量，計算細(xì)胞質(zhì)量；清洗后以1000 r/min離心速度離心10 min；棄上清液，留細(xì)胞沉淀；加入0.2 ml無水乙醇進行勻漿，冰水浴條件下超聲破碎（功率300 W,3 s/次，間隔9 s，重復(fù)5次），制備好的勻漿直接測定；準(zhǔn)備96孔板，以樣本工作液為1∶100比例混勻，每個樣本3個平行組加入96孔板中；37℃孵育10 min，設(shè)置分光光度計波長510 nm，測定各管吸光度值；膽固醇含量（mmol/g組織）=（樣本OD值-空白OD值）/（校準(zhǔn)OD值-空白OD值）×校準(zhǔn)品濃度（mmol/L）/待測樣本質(zhì)量濃度（g/L）。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法
油紅O染色拍照結(jié)束后，采用Image J分析軟件計算出染紅區(qū)域面積和細(xì)胞總面積的比值，對油紅O染色的巨噬細(xì)胞進行定量分析；采用spss 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，用沃勒-鄧肯（W）法進行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 光鏡下觀察油紅O染色處理組巨噬細(xì)胞泡沫化情況
o-x LDL組及ox-LDL+SRT1720組0、12、24 h細(xì)胞泡沫化程度均高于Control組，其中0 h加入SRT1720對巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制效果最佳，見圖1～圖3。
2.2 油紅O染色
2.2.1 ox-LDL處理不同時間加入SRT1720的巨噬細(xì)胞油紅染色比
SRT1720直接干預(yù)可以顯著抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化，隨著泡沫化程度的增加，藥物的抑制效果呈遞減趨勢，見圖4。
圖1 ox-LDL與SRT1720同時干預(yù)后巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)沉積
圖2 ox-LDL處理12 h后加入SRT1720干預(yù)后巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)沉積
圖3 ox-LDL處理24 h后加入SRT1720干預(yù)后巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)沉積
圖4 ox-LDL處理不同時間加入SRT1720的巨噬細(xì)胞油紅染色比
2.2.2 各組細(xì)胞中油紅染色脂質(zhì)沉積比較
與Control組比較，ox-LDL組0、12、24 h油紅染色比均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與ox-LDL組比較，oxLDL+SRT1720組0、12 h油紅染色比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05),24 h組油紅染色比略降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；巨噬細(xì)胞泡沫化后，SRT1720越早期給藥其抑制效果越佳，見表1。
2.3 膽固醇測定
與Control組比較，ox-LDL組0、12、24膽固醇含量均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與ox-LDL組比較，ox-LDL+SRT1720組0 h膽固醇含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05),12、24 h膽固醇含量均略減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；在巨噬細(xì)胞剛開始泡沫化時SRT1720給藥有抑制效果，見表2。
表1 各組細(xì)胞中油紅染色脂質(zhì)沉積比較（±s,%)
表2 各組細(xì)胞中膽固醇含量比較（±s,mmol/g)
3 討論
動脈粥樣硬化是慢性炎癥性、嚴(yán)重危害人類健康的疾病，而脂質(zhì)氧化在動脈粥樣硬化的形成與發(fā)展過程中起著重要作用。有研究表明[2]，巨噬細(xì)胞參與了動脈粥樣硬化的全過程，是泡沫細(xì)胞形成過程中的關(guān)鍵因素；另有研究報道[14]，在兔主動脈晚期動脈粥樣硬化病灶中大約45%的細(xì)胞，在人冠狀動脈粥樣硬化病灶中超過50%的細(xì)胞屬于VSMC來源，且多于巨噬細(xì)胞。血液中的單核細(xì)胞會在血管內(nèi)皮受損的情況下通過內(nèi)皮間隙，然后在內(nèi)膜下轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞可以介導(dǎo)滲入血管內(nèi)皮下的低密度脂蛋白（LDL）發(fā)生氧化修飾，最終形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。巨噬細(xì)胞吞噬大量ox-LDL，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，最終形成泡沫細(xì)胞。因此，減少膽固醇的流入或增加其流出對減少動脈粥樣硬化的發(fā)生具有十分重要的意義。
已有研究表明，SIRT1是去乙?；讣易澹⊿IRT1-7）的一員，在維持細(xì)胞能量、脂質(zhì)代謝及葡萄糖穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用[7]。近年來，SIRT1在動脈粥樣硬化防治方面的保護作用逐漸受到研究者的關(guān)注。SRT1720是人工合成的SIRT1特異性激活劑，通過與氨基末端催化區(qū)的變構(gòu)位點結(jié)合，連接到SIRT1酶-肽底物復(fù)合物上，降低乙酰化底物的米氏常數(shù)值，從而激活SIRT1。曹小潔等[7]的研究已證明SRT1720可以抑制ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞的形成，但是對其最佳的給藥時間尚無研究。為了提高藥物的利用率和降低藥物對人體的傷害，不同時期的動脈粥樣硬化治療應(yīng)該對應(yīng)不同的藥物。SRT1720具有一定的毒性，因此通過設(shè)定準(zhǔn)確的服藥時間，不僅可以給獲得較好的治療效果，還能降低不必要用藥給人體帶來的危害。
本研究采用在同等操作環(huán)境下，巨噬細(xì)胞經(jīng)ox-LDL處理不同時間SRT1720給藥，比較巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制情況。油紅O染色和膽固醇測定結(jié)果顯示，ox-LDL干預(yù)時間越久，其泡沫化程度越高，ox-LDL與SRT1720同時加入可以顯著抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化，由此推測動脈粥樣硬化在此時期給予SRT1720治療，幾乎可以完全抑制巨噬細(xì)胞對氧化低密度脂蛋白的攝取。而隨著泡沫化程度的增加，相同量的SRT1720抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的效能有所降低。因此推測SRT1720可以抑制巨噬細(xì)胞對氧化低密度脂蛋白的攝入，對已經(jīng)泡沫化的巨噬細(xì)胞發(fā)生逆向轉(zhuǎn)變的效果并不明顯。
研究顯示[15]，在動脈粥樣硬化早期發(fā)現(xiàn)疾病的患者較少，動脈粥樣硬化疾病早期病理變化和特征性標(biāo)志是斑塊內(nèi)泡沫巨噬細(xì)胞的浸潤，泡沫細(xì)胞的數(shù)量和分布是引起斑塊不穩(wěn)定性的重要發(fā)病基礎(chǔ)，與臨床急性心血管事件的發(fā)生呈顯著相關(guān)。有研究試圖通過影像學(xué)手段，實現(xiàn)對動脈粥樣硬化易損斑塊形態(tài)和成分性質(zhì)的早期可視化診斷[16]，經(jīng)過診療一體化納米粒子[17]的預(yù)治療，可以降低血管完全堵塞的風(fēng)險。尤其是對斑塊內(nèi)泡沫巨噬細(xì)胞進行早期識別及動態(tài)定量監(jiān)測，對于預(yù)防急性心腦血管事件的發(fā)生具有重要意義，因此診療一體化納米探針的制備在預(yù)防動脈粥樣硬化斑塊形成的研究具有重要意義。
綜上所述，SRT1720對于動脈粥樣硬化的早期治療效果最好。如果可將其制成納米探針，對斑塊內(nèi)泡沫巨噬細(xì)胞進行早期靶向診斷治療。由于研究表明對于中晚期的動脈粥樣硬化巨噬細(xì)胞泡沫化抑制情況并不明顯，因此其治療方法及加藥量尚不明確。SRT1720對巨噬細(xì)胞泡沫化的影響還有待進一步研究，可能對于提高其臨床的治療效果具有重要意義。
參考文獻(xiàn)
[1]Yazgan B,Sozen E,Karademir B,et al.CD36 expression in peripheral blood mononuclear cells reflects the onset of atherosclerosis[J].Biofactors,2018,44(6):588-596.
[2]徐芳,蒙穎,王志祿,等.羅格列酮對RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量及SR-BⅠ表達(dá)的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,32(12):1792-1795.
[3]Zhang MJ,Zhou Y,Chen L,et al.SIRT1 improves VSMC functions in atherosclerosis[J].Prog Biophys Mol Biol,2016,121(1):11-15.
[4]Zhao L,Varghese Z,Moorhead JF,et al.CD36 and lipid metabolism in the evolution of atherosclerosis[J].Br Med Bull,2018,126(1):101-112.
[5]Lin M,Xu X,Lee HL,et al.Fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia due to anti-CD36 antibodies:antibody evaluations by CD36-transfected cell lines[J].Transfusion,2018,58(1):189-195.
[6]Stein S,Lohmann C,Schafer N,et al.SIRT1 decreases Lox-1-mediated foam cell formation in atherogenesis[J].Eur Heart J,2010,31(18):2301-2309.
[7]曹小潔,張明杰,張莉莉,等.SIRT1通過抑制NF-κB信號通路而抑制oxLDL誘導(dǎo)的VSMC源性泡沫細(xì)胞形成[J].四川醫(yī)學(xué),2019,40(5):449-453.
[8]Zeng HT,Fu YC,Yu W,et al.SIRT1 prevents atherosclerosis via liver-X-receptor and NF-κB signaling in a U937 cell model[J].Mol Med Rep,2013,8(1):23-28.
[9]Mitchell SJ,Martin-Montalvo A,Mercken EM,et al.The SIRT1 activator SRT1720 extends lifespan and improves health of mice fed a standard diet[J].Cell Rep,2014,6(5):836-843.
[10]Luo G,Jian Z,Zhu Y,et al.Sirt1 promotes autophagy and inhibits apoptosis to protect cardiomyocytes from hypoxic stress[J].Int J Mol Med,2019,43(5):2033-2043.
[11]Liu B,Lei M,Hu T,et al.Inhibitory effects of SRT1720 on the apoptosis of rabbit chondrocytes by activating SIRT1 via p53/bax and NF-κB/PGC-1αpathways[J].J Huazhong Univ sci Technolog Med Sci,2016,36(3):350-355.
[12]Wan X,Wen JJ,Koo SJ,et al.SIRT1-PGC1α-NFκB Pathway of Oxidative and Inflammatory Stress during Trypanosoma cruzi Infection:Benefits of SIRT1-Targeted Therapy in Improving Heart Function in Chagas Disease[J].PLoS Pathog,2016,12(10):e1005954.
[13]Wen J.SRT1720 inhibition of M1 macrophages and chronic inflammation in Chagas disease[J].The Journal of Immunology,2016,196(1):124.
[14]Allahverdian S,Chehroudi AC,McManus BM,et al.Contribution of intimal smooth muscle cells to cholesterol accumulation and macrophage-like cells in human atherosclerosis[J].Circulation,2014,129(15):1551-1559.
[15]Das D,Sivasubramanian K,Yang C,et al.On-chip generation of microbubbles in photoacoustic contrast agents for dual modal ultrasound/photoacoustic in vivo animal imaging[J].Sci Rep,2018,8(1):6401.
篇4
【摘要】
目的： 檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLRs表達(dá)情況及糖皮質(zhì)激素甲基強的松龍對TLRs mRNA表達(dá)的影響. 方法： 應(yīng)用RTPCR檢測正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR113的表達(dá)；并以甲基強地松龍為免疫抑制劑，誘導(dǎo)小鼠免疫抑制后檢測腹腔巨噬細(xì)胞TLRs mRNA表達(dá)變化. 結(jié)果： 已發(fā)現(xiàn)的TLR113在正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞均有表達(dá)；小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)糖皮質(zhì)激素處理后，部分TLRs在mRNA水平上可被上調(diào). 結(jié)論： Toll樣受體是抗真菌先天免疫的重要組成部分. 甲基強的松龍對巨噬細(xì)胞有毒性作用，甲基強的松龍注射后可導(dǎo)致小鼠腹腔巨噬細(xì)胞明顯減少.
【關(guān)鍵詞】 小鼠；潑尼松龍；免疫抑制法；Toll樣受體
【Abstract】 AIM: To test the expression of tolllike receptor 113 (TLR113) mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice and the change of TLRs mRNA expression in peritoneal macrophages of immunosuppressed mice. METHODS: The expression of TLR113 mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice was determined by RTPCR technique. Immunosuppressed mice were induced by intraperitoneal injections of prednisolone. The expression of TLRs mRNA in the peritoneal macrophages of immunosuppressed mice was tested with RTPCR. RESULTS: All thirteen of the TLRs reported to date were present in the macrophages of normal mice. Some of TLRs were upregulated in mRNA level when the mice were treated with glucocorticoids. CONCLUSION: TLRs are important component parts of innate immunity to fungal infections. Prednisolone has a toxic effect to macrophages and decreases the peritoneal macrophages of the mice.
【Keywords】 mice; prednisolone; immunosuppression; tolllike receptor
0引言
Toll受體在果蠅的發(fā)育和抗真菌免疫中具有顯著作用. 實驗證實TLRs(tolllike receptors)表達(dá)異常會使免疫炎癥反應(yīng)不能正常發(fā)生，降低機體對病原微生物的清除能力［1］. 糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids， GC)可有效控制炎癥和抑制免疫反應(yīng)［2］. 近20年來，由于應(yīng)用糖皮質(zhì)激素而致機體免疫機能低下的患者患侵襲性曲霉菌病日趨增多. 體內(nèi)外實驗顯示糖皮質(zhì)激素在免疫和炎癥應(yīng)答中有促進和抑制作用，甚至出現(xiàn)雙向作用［3］. 為了解糖皮質(zhì)激素對TLRs表達(dá)的影響，我們以甲基強地松龍為免疫抑制劑，在誘導(dǎo)小鼠免疫抑制后檢測腹腔巨噬細(xì)胞TLRs mRNA的表達(dá)情況.
1材料和方法
1.1材料
Balb/c小鼠24只，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量20～25g（第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心）. 總RNA提取試劑TRIZOL Reagent（Gibco公司），MMLV Reverse Transcriptase 和Reverse Transcription System(Promega 公司)，Taq DNA聚合酶和dNTPs(TaKaRa公司)，不完全RPMI1640( Life Technology公司)，甲基強的松龍，40 mg/支(比利時法瑪西亞普強公司).
1.2方法
1.2.1糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)小鼠免疫抑制及腹腔巨噬細(xì)胞計數(shù)
將免疫抑制組小鼠12只皮下注射甲基強的松龍100 mg/kg·d， 共3 d. 正常對照組小鼠12只皮下注射同體積注射用水. 第4日脫頸處死小鼠，浸泡于750 mL/L 乙醇1 min，剪開腹部皮膚，暴露腹部，用注射器吸取5 mL無血清RPMI1640培養(yǎng)液注入腹腔，輕揉腹腔1～2 min，用吸管吸取腹腔巨噬細(xì)胞懸液，移入離心管中計數(shù).
1.2.2細(xì)胞總RNA的提取
收集腹腔巨噬細(xì)胞懸液，2000 g離心10 min，棄上清，RPMI1640洗滌1次. 用TRIZOL Reagent一步法提取巨噬細(xì)胞總RNA.
1.2.3TLR1~13 PCR引物
根據(jù)GenBank公布的TLR1～13（除TLR10）已知序列設(shè)計引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成（表1）. 表1基因名稱和序列（略）
1.2.4RTPCR擴增TLR1～13基因及內(nèi)參照βactin基因按照說明書，以Random Primers為引物，將從小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA. 分別用TLR及內(nèi)參照βactin兩組引物進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30s，循環(huán)32次，延伸7 min.
1.2.5擴增產(chǎn)物檢測取10 μL PCR產(chǎn)物，15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳40 min，隨后在凝膠成像系統(tǒng)中分析電泳帶的吸光度值. TLRs的相對含量為TLRs與內(nèi)參βactin吸光度比值表示.
統(tǒng)計學(xué)處理：實驗結(jié)果以x±s表示，兩組間差異比較用t檢驗，多組間比較采用KruskalWallis H檢驗.
2結(jié)果
2.1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量變化將甲基強的松龍注射后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量由（6.3±1.8）×106/只降至（3.2±0.6）×106/只，前后比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P
2.2TLR113在正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的表達(dá)經(jīng)RTPCR檢測，TLR113在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞均有表達(dá)(圖1).
2.3免疫抑制狀態(tài)下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLRs的表達(dá)變化糖皮質(zhì)激素可上調(diào)巨噬細(xì)胞上部分TLRs mRNA表達(dá)(圖1)，包括TLR2，3，4，5，6，8. 表達(dá)量增加約1.2～2.0倍(表2). 若
3討論
TLRs在不同組織細(xì)胞的表達(dá)各異 ，可分為廣泛表達(dá)、限制性表達(dá)或特異性表達(dá)［4］，如TLR1分布于各類免疫細(xì)胞，TLR2，4，5只在髓源性細(xì)胞表達(dá)，TLR3則主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞. 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為常駐巨噬細(xì)胞，是防御病原微生物入侵的第一道防線. Muzio 等［5］研究顯示， 單核/巨噬細(xì)胞在發(fā)育成熟的不同階段表達(dá)大多數(shù)TLRs，但不表達(dá)TLR3. 我們的結(jié)果證明TLR113在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞均有表達(dá)，包括TLR3. 當(dāng)局部受到細(xì)菌、真菌及病毒感染時，巨噬細(xì)胞上的TLRs可識別不同的病原體相關(guān)分子模式如細(xì)菌脂肽、dsRNA，LPS和細(xì)菌鞭毛等并被活化，提供迅速而有效的先天免疫應(yīng)答并啟動獲得性免疫應(yīng)答.
多種病原微生物成分或細(xì)胞因子可上調(diào)或下調(diào)TLRs表達(dá)，如LPS可誘導(dǎo)TLR2，TLR4及TLR9的表達(dá)，IL6可使TLR7的表達(dá)明顯升高，INFγ可上調(diào)TLR9的表達(dá). Renshaw等［6］研究證實，老齡小鼠的脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞TLR1～9的表達(dá)顯著減少，且TLRs功能下降，這可能部分解釋老年人對各種病原菌感染的易感性增加. 糖皮質(zhì)激素是廣泛應(yīng)用的抗炎劑，其抗炎效應(yīng)的發(fā)揮是通過下調(diào)依賴NFκB的大量炎癥應(yīng)答相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，而TLRs的上調(diào)可誘導(dǎo)NFκB的活化［7］. 研究發(fā)現(xiàn)，大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素是機會性真菌易感的主要危險因素之一，理論上推測糖皮質(zhì)激素可能下調(diào)TLRs表達(dá). 我們的結(jié)果顯示，甲基強的松龍在mRNA水平上調(diào)巨噬細(xì)胞部分TLRs表達(dá)，其調(diào)節(jié)機制還不十分清楚. Homma等［8］研究了地塞米松對呼吸道上皮細(xì)胞TLRs家族成員表達(dá)的調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)地塞米松可上調(diào)TLR2～6的表達(dá)，與我們的研究結(jié)果相一致. Shuto等［7］研究證實，地塞米松協(xié)同增強非典型流感嗜血桿菌誘導(dǎo)的TLR2上調(diào)，是通過p38MAPK信號途徑的負(fù)調(diào)節(jié). Franchimont等［9］將地塞米松加入LPS刺激的全血細(xì)胞培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)地塞米松可增加IL10的分泌，而降低TNFα的分泌，證明了糖皮質(zhì)激素可強烈抑制Th1細(xì)胞促炎因子的分泌，而對Th2細(xì)胞抗炎因子的分泌有正調(diào)節(jié)作用. 糖皮質(zhì)激素對巨噬細(xì)胞部分TLRs有上調(diào)作用，免疫功能低下患者易發(fā)生機會性感染，但究竟是通過對Toll樣受體信號通路中哪些環(huán)節(jié)的抑制而發(fā)揮作用的？糖皮質(zhì)激素上調(diào)部分TLRs表達(dá)的準(zhǔn)確分子機制是什么？這將有待于進一步研究.
以往研究認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素可明顯改變單核巨噬細(xì)胞的功能，能抑制巨噬細(xì)胞的吞噬和加工處理抗原功能，阻止單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞. 我們在實驗中觀察到糖皮質(zhì)激素甲基強的松龍對巨噬細(xì)胞的毒性作用，甲基強的松龍注射后可導(dǎo)致小鼠腹腔巨噬細(xì)胞明顯減少，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)甲基強的松龍作用后細(xì)胞生長受到抑制甚至死亡. 尚未見文獻(xiàn)報道糖皮質(zhì)激素對巨噬細(xì)胞的直接毒性作用，甲基強的松龍抑制巨噬細(xì)胞生長或誘導(dǎo)死亡可能是免疫抑制小鼠對煙曲霉菌易感的機制之一.
【參考文獻(xiàn)】
［1］Bellocchio S， Montagnoli C， Bozza S， et al. The contribution of the Tolllike/IL1 receptor superfamily to innate and adaptive immunity to fungal pathogens in vivo［J］. J Immunol， 2004 ，172(5):3059-3069.
［2］Ashwell JD， Lu FW， Vacchio MS. Glucocorticoids in T cell development and function［J］. Annu Rev Immunol， 2000，18:309-345. Review.
［3］Galon J， Franchimont D， Hiroi N， et al. Gene profiling reveals unknown enhancing and suppressive actions of glucocorticoids on immune cells［J］. FASEB J， 2002，16(1):61-71.
［4］Zarember KA， Godowski PJ. Tissue expression of human Tolllike receptors and differential regulation of Tolllike receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes， their products， and cytokines［J］. J Immunol， 2002，168(2):554-561.
［5］Muzio M， Bosisio D， Polentarutti N， et al. Differential expression and regulation of tolllike receptors (TLR) in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells［J］. J Immunol， 2000，164(11):5998-6004.
［6］Renshaw M， Rockwell J， Engleman C， et al. Cutting edge: impaired Tolllike receptor expression and function in aging［J］. J Immunol， 2002，169(9):4697-4701.
［7］Shuto T， Imasato A， Jono H， et al.. Glucocorticoids synergistically enhance nontypeable Haemophilus influenzaeinduced Tolllike receptor 2 expression via a negative crosstalk with p38 MAP kinase［J］. J Biol Chem， 2002，277(19):17263-17270.
［8］Homma T， Kato A， Hashimoto N， et al. Corticosteroid and cytokines synergistically enhance tolllike receptor 2 expression in respiratory epithelial cells［J］. Am J Respir Cell Mol Biol， 2004，31(4):463-469.
篇5
巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）是一種重要的前炎癥因子，主要作用為抑制巨噬細(xì)胞的游走移動，促進巨噬細(xì)胞在炎癥局部浸潤、聚集、增生、活化，增強其黏附、吞噬作用，還能促進多種炎性細(xì)胞因子的生成。MIF廣泛參與機體多種生理及病理生理學(xué)反應(yīng)，包括炎性反應(yīng)、腫瘤生成和皮膚創(chuàng)傷修復(fù)等。MIF在病毒性心肌炎發(fā)病機制中起重要作用。近年來，隨著克隆MIF cDNA的成功及其結(jié)構(gòu)的闡明，MIF的特殊生物功能及其在不同炎癥性疾病中的重要作用已日益為人們所重視。病毒性心肌炎（viral myocarditis，VM）是由親心肌病毒感染所致以心肌炎癥病變?yōu)橹鞯募膊?，MIF是一種重要的促炎因子，MIF在VMC發(fā)病機制及治療中的作用成為目前研究的熱點。因此，本文將MIF的最新進展及其與VM的關(guān)系作一綜述。
1 MIF的細(xì)胞和組織學(xué)來源
MIF既產(chǎn)生于激活的T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞及腦垂體前葉，也產(chǎn)生于多種組織細(xì)胞，哺乳動物的MIF mRNA和蛋白廣泛表達(dá)于各種各樣的造血細(xì)胞、中樞和外周神經(jīng)細(xì)胞、具有內(nèi)分泌和外分泌功能的上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、表皮細(xì)胞、汗腺細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚角質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺、前列腺及等[1]。單核巨噬細(xì)胞是血液中MIF的主要來源。
2 MIF的膜受體
細(xì)胞因子通常需要與其相應(yīng)的受體結(jié)合，活化信號傳導(dǎo)途徑而發(fā)揮生理作用。目前大量研究證實MIF激活絲裂原激活蛋白激酶（MAPKs）家族成員之一的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/ERK2）傳導(dǎo)通路，而對其激活方式是受體依賴型還是非受體依賴型的研究也是近年來的熱點。2003年Leng等[2]研究發(fā)現(xiàn)，CD74是MIF的可能膜受體。MIF可能通過與細(xì)胞膜表面蛋白CD74的細(xì)胞外基團結(jié)合而發(fā)揮作用。CD74為MHCⅡ類相關(guān)恒定鏈，是一種跨膜蛋白。MIF與CD74分子的胞外部分即73-232位氨基酸殘基高親和力結(jié)合后，激活ERK磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，從而引起各種細(xì)胞的增生及炎性介質(zhì)的合成與釋放，產(chǎn)生各種生理效應(yīng)，而兩種抗CD74抗體（LN2或M-B741）可明顯阻抑MIF的上述作用。CD74胞外部分的可溶性片段sCD7473-232及抗CD74 中和性抗體均可抑制細(xì)胞膜上的CD74分子與MIF的結(jié)合，從而阻抑MIF的促炎作用。
3 MIF的基因與蛋白結(jié)構(gòu)
人類基因組中MIF定位于21號染色體(21q22，3)，為單拷貝基因。但在小鼠基因組中，則是由10個以上假基因組成的多拷貝基因，定位于10號染色體上。MIF的基因較小，人和小鼠的MIF mRNA長度大約為0.8 kb。1995年，美國Duke大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Picower醫(yī)學(xué)研究所Mitchell等人首次克隆了人MIF基因。人MIF基因全長約2 119 bp，其編碼區(qū)由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，啟動子區(qū)域有幾個保守的DNA序列可以和轉(zhuǎn)錄因子AP1、NF-κB、ETS、GATA、SP1、cAMP結(jié)合元件反應(yīng)蛋白等結(jié)合，從而受其調(diào)控。在MIF cDNA序列中，第173位堿基G或C的變化構(gòu)成了MIF的單核苷酸多態(tài)性。MIF蛋白結(jié)構(gòu)獨特，為α/β結(jié)構(gòu)，以同源三聚體形式存在，通過單體內(nèi)的β2片層及α2螺旋C末端之間氫鍵相互作用加以穩(wěn)定[3]。人和嚙齒類動物MIF蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)為115位氨基酸殘基，相對分子量為12.5 kD。不同種動物的MIF蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列同源性大于80%，同源性最高的為大鼠和小鼠的MIF蛋白質(zhì)，僅差1個氨基酸，人和小鼠的同源性也高達(dá)90%。人和大鼠的MIF蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)基本相似，差別僅在于C末端的11氨基酸堿基上。
4 MIF的生物學(xué)功能
4.1 免疫調(diào)節(jié)功能：MIF是先天性免疫和獲得性免疫的重要調(diào)節(jié)因子，是宿主抵抗致病微生物免疫防御系統(tǒng)和應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)中不可缺少的成員。在免疫過程中，MIF不僅有抑制巨噬細(xì)胞游走、黏附、吞噬和聚集的功能，還促進其在炎癥局部浸潤、增生、激活及通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進某些細(xì)胞因子的表達(dá)，分泌細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ，同時使NO釋放增加和磷脂酶A2的表達(dá)增強，產(chǎn)生促炎作用[4~5]；而抗MIF中和性抗體則對過度炎癥反應(yīng)具有顯著的保護作用；反義MIF可以下調(diào)Toll蛋白樣受體4-LPS受體復(fù)合物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，減少Gˉ細(xì)菌LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生，同時負(fù)性調(diào)節(jié)NF-κB調(diào)節(jié)的相關(guān)細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄。
4.2 對腫瘤的作用：有報道發(fā)現(xiàn)肺癌、鼻咽癌、膀胱癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌以及顱咽管瘤等細(xì)胞上有MIF mRNA及蛋白表達(dá)，并且多數(shù)呈高表達(dá)[6]。進一步研究可證實轉(zhuǎn)移生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor， PDGF）均可上調(diào)MIFmRNA及蛋白表達(dá)，說明MIF可直接或通過協(xié)助其它生長因子而間接地促進腫瘤細(xì)胞生長。近期又有發(fā)現(xiàn)，抗MIF抗體可有效地抑制腫瘤細(xì)胞在淋巴細(xì)胞系和血管內(nèi)皮細(xì)胞系中的生長及新血管的形成，從而有效地減慢腫瘤的生長速度。另外，有研究提示，癌細(xì)胞的MIF高表達(dá)可能影響了腫瘤細(xì)胞間的黏附性，使腫瘤細(xì)胞更加容易相互分離移動，并向周圍鄰近組織侵襲，從而促進惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。目前，關(guān)于MIF促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制還不清楚，有研究認(rèn)為MIF對抑癌基因P53的抑制作用可能與其致癌作用有關(guān)[7，8]。另外，MIF也可以通過促進基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的表達(dá)增加，從而促進癌細(xì)胞向淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。
4.3 神經(jīng)內(nèi)分泌功能：MIF作為垂體激素和糖皮質(zhì)激素的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑。某些促甲狀腺素垂體細(xì)胞通過下丘腦-垂體-腎上腺軸起始宿主應(yīng)答時伴有MIF的釋放，在下丘腦切除的裸鼠里注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）后發(fā)現(xiàn)垂體細(xì)胞釋放MIF的量與血清中MIF的量基本接近。在下丘腦-垂體-腎上腺軸受刺激后，垂體以“激素樣”方式分泌MIF。MIF可能是一種對糖皮質(zhì)激素起負(fù)調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。
4.4 酶學(xué)功能：MIF能催化互變異構(gòu)反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，具有3種催化活性作用[9]：為多巴色素異構(gòu)酶；羥苯丙酮酸互變異構(gòu)酶，能催化羥苯丙酮和羥苯丙酮酸的酮基-烯酸的互變異構(gòu)；谷光甘肽（GSH）和二羥酯酰胺作為MIF生理性氧化還原底物，并且它還作為一種新型蛋白質(zhì)-巰基氧化還原酶參與氧化還原反應(yīng)。但MIF明確的生理和病理生理功能與催化特性間的關(guān)系并未確定。
4.5 損傷修復(fù)功能：有研究發(fā)現(xiàn)在角膜損傷的愈合過程中，伴隨著角膜細(xì)胞浸潤和內(nèi)皮細(xì)胞的分化，MIFmRNA的表達(dá)水平也相應(yīng)增加。隨后發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮膚損傷愈合過程中，MIF表達(dá)有增加趨勢，而應(yīng)用抗MIF抗體可推遲損傷的愈合。近期Mitchell 等發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性、外源性MIF均可刺激NIH/3T3成纖維細(xì)胞的增殖，MIF的這種促增殖效應(yīng)與P44/P42有絲分裂原激活的蛋白激酶的活性有關(guān)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)MIF可通過蛋白激酶A來調(diào)節(jié)胞質(zhì)中磷脂酶的活性；而外源性增加的rMIF還可逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素對胞質(zhì)中磷脂酶A2的抑制作用，
5 MIF與VM
VM是臨床較常見的疾病之一，患病率達(dá)21.83/10萬，且年齡越小，發(fā)病率越高。病毒感染后所致的心臟炎癥可累及心肌細(xì)胞、間質(zhì)組織、血管成分及心包，而導(dǎo)致急性、亞急性和慢性病變。VM急性期可引起心衰、心律失常等癥狀，極少數(shù)患者因嚴(yán)重心律失常、心力衰竭和心源性休克而死亡。部分患者由于急性期后炎癥持續(xù)，轉(zhuǎn)為慢性心肌炎，出現(xiàn)進行性心臟擴大、心功能減退、頑固性心律失常，經(jīng)過數(shù)年或更長時間后死于并發(fā)癥。引起VM的病原體有20余種，但最常見的為柯薩奇病毒B組（coxsackievirus B，CVB），有50%以上的VM與之有關(guān)，其次為腺病毒（adenovirus，ADV）。VM的發(fā)病機制至今尚未完全闡明，目前多數(shù)認(rèn)為是病毒直接損害和免疫變態(tài)反應(yīng)所致。目前臨床上VM常采用支持治療、中藥、抗心力衰竭和抗病毒藥物、免疫抑制劑等治療方法，但療效欠佳，部分預(yù)后不良[10]。因此，深入研究該病的發(fā)病機制，闡明其病理生理過程，尋找有效的藥物治療和生物治療靶點，成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點和難點。
近年來VM發(fā)病率呈增長趨勢，現(xiàn)已知CVB是VM的主要病原，并認(rèn)為CVB誘導(dǎo)的心肌炎可能在感染過程中依賴細(xì)胞因子的釋放，細(xì)胞因子在VM發(fā)病機制中占有主導(dǎo)地位。MIF是新發(fā)現(xiàn)的一種多效型細(xì)胞因子，是一種重要的前炎癥因子，由單核巨噬細(xì)胞、激活的T細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生，其主要作用為抑制巨噬細(xì)胞的游走移動，促進巨噬細(xì)胞在炎癥局部浸潤、聚集、增生、活化，增強其黏附、吞噬作用，此外，還能促進IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等多種細(xì)胞因子的生成，從而間接增強巨噬細(xì)胞的功能，參與機體炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答。最近，MIF在心肌炎中的作用受到廣泛關(guān)注。Matsui等[11]在實驗性自身免疫性心肌炎中發(fā)現(xiàn)，心肌組織MIF mRNA和蛋白水平明顯增加，此外，血清MIF濃度也顯著升高，而通過MIF中和抗體阻斷MIF的表達(dá)則可以明顯減輕心肌的病變程度，以及降低心肌中VCAM-1（血管細(xì)胞間黏附分子）、IL-1β、TNF-α的表達(dá)。同樣，Shioji等[12]在研究自身免疫性巨細(xì)胞性心肌炎時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)注射MIF中和抗體后，心肌炎癥病變也顯著減輕。郭富強等[13]的研究亦發(fā)現(xiàn)，MIF在柯薩奇病毒性心肌炎小鼠心肌表達(dá)上調(diào)，與心肌損害程度密切相關(guān)。張小佛等[14]報道急性VM患兒血清MIF水平明顯升高，并與CK-MB呈正相關(guān)。這些研究提示，MIF可能與VM的形成有密切關(guān)系，有望成為治療和預(yù)防VM的一種關(guān)鍵靶分子。
6 展望
MIF作為機體的一種多效性的細(xì)胞因子，在炎癥應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)內(nèi)分泌和細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用，近年來其在VM發(fā)生中的致病作用倍受人們關(guān)注。盡管目前對其致病機制還不完全清楚，但MIF的中和抗體已經(jīng)在動物實驗和臨床上取得較好的療效，另外，其他拮抗MIF的藥物也相繼被發(fā)現(xiàn)，如維生素E和西替利嗪等。因此，隨著研究的深入，針對MIF的干預(yù)治療將為臨床治療VM提供一個新的思路和方法。
參考文獻(xiàn)：
[1] Metz CN，Bucala R.Cytokine Ref [M].San Diego:Academic Press，2000.703.
[2] Leng L，Metz CN，F(xiàn)ang Y，et al. MIF signal transduction initiated by binding to CD74[J]. J Exp Med，2003，197(11):1467.
[3] Swope MD，Sun HW，Klockow B， et al.Macrophage migration in-hibitory factor interactions with glutathione and 5-Hexylgluthione[J]. J Biol Chem，1998，273(24):14877.
[4] Abe R，Peng T，Sailor S，et al.Regulation of the CTL response by macrophage migration inhibitory factor[J].J Immunol，2001，166(2):747.
[5] Aeberli D，Leech M，Morand EF. Macrophage migration inhibitory factor and glucocorticoid sensitivity[J].Rheumatology，2006，45(8): 937.
[6] 卞麗娟，李 智.巨噬細(xì)胞移動抑制因子與腫瘤[J].國際腫瘤學(xué)雜志，2006，33(9):661.
[7] Sun B，Nishihira J，Yoshiki T，et al.Macrophage migration inhibitory factor promotes tumor invasion and metastasis viaRho-dependent pathway[J]. Clin Cancer Res，2005，11(3):1050.
[8] Fingerle RG，Petrenko O，Metz CN，et al. The p53-dependent effects of macrophage migration inhibitory factor revealed by gene targeting[J]. Proc Natl Acad Sci Usa，2003，100(16):9354.
[9] Pennock JL，Wipasa K，Gordge MP，et al.Interaction of macrophage migration inhibitory factor with haematin [J].J Biol Chem， 1998， 273(2)：905.
[10] Magnani JW，Dec GW. Myocarditis:current trends in diagnosis and treatment[J].Circulation，2006，113(6):876.
[11] Matsui Y，Okamoto H，Jia N，et al.Blockade of macrophage migra-tion inhibitory factor ameliorates experimental autoimmune my-ocarditis[J]. J Mol Cell Cardiol，2004，37(2):557.
[12] Shioji K，Kishimoto C，Sasayama S. Fc receptor-mediated inhibitoryeffect of immunoglobulin therapy on autoimmune giant cell my-ocarditis: concomitant suppression of the expression of dendritic cells[J]. Circ Res，2001，89(7):540.
[13] 郭富強，于小華，李雙杰，等. 巨噬細(xì)胞移動抑制因子在病毒性心肌炎小鼠心肌中表達(dá)[J].臨床兒科雜志，2007，25(10):818.
篇6
【關(guān)鍵詞】 β葡聚糖 胞內(nèi)游離鈣 環(huán)磷酸腺苷 RAW264.7細(xì)胞系 增殖
［Abstract］ Objective: To explore the effect of βglucan on proliferation， intracellular calcium and cAMP levels of RAW264.7 macrophage cell line.Methods： Cell growth and proliferation were detected by neutral red colorimetric assay， protein synthesis by Lowry′s test， and the concentration of cytosolic calcium and cAMP were determined continuously. Results： Cell growth and protein synthesis were enhanced by βglucan; the concentration of cytosolic calcium was elevated 3～5 min after treatment with βglucan cAMP level increased 1 min after the treatment and maintained at high level. Conclusion： Cytosolic calcium and cAMP were important signal molecules in evaluating effect of βglucan on RAW264.7 cell line.
［Key words］ βglucan; intracellular calcium; cAMP; RAW264.7 cell line; proliferation
隨著免疫抑制劑、激素、廣譜抗生素的大量應(yīng)用，器官移植技術(shù)的廣泛開展、各種導(dǎo)管的廣泛應(yīng)用及腫瘤治療的廣泛應(yīng)用，真菌感染尤其深部真菌性醫(yī)院感染日益增多。 β葡聚糖是真菌細(xì)胞壁含量最高的多糖。本研究以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為觀察對象，觀察不同濃度及不同時間的β葡聚糖對RAW264.7細(xì)胞的直接影響， 特別是對細(xì)胞內(nèi)第二信使傳遞的影響， 以探討β葡聚糖對RAW264.7細(xì)胞的作用機制。
1 材料與方法
1.1 試 劑
RPMI1640、胎牛血清購自Gibco公司；Fura2 AM 購自中國科學(xué)院藥物所；β葡聚糖和EGTA購自Sigma公司；其余試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)
小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。于37℃，5%CO2濕潤環(huán)境中培養(yǎng)， 每3天更換1次培養(yǎng)液， 細(xì)胞生長匯合成單層細(xì)胞時及時傳代， 常規(guī)培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI1640。
1.3 細(xì)胞生長曲線和蛋白質(zhì)含量的測定
取對數(shù)生長期的細(xì)胞按3×103 個/孔接種于96孔板(Cellstar)，共接種16板。待細(xì)胞貼壁后，吸出孔內(nèi)的培養(yǎng)液和未貼壁的細(xì)胞。各給藥組分別給予含12.5，25，50，100，200和400 μg/ml β葡聚糖的培養(yǎng)液200 μl，進行培養(yǎng)。每板上作對照，每個β葡聚糖濃度作3個平行孔。每天定時取上述培養(yǎng)板2塊， 于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況， 然后將其中1塊板以中性紅比色法［1］檢測細(xì)胞生長情況，另1板用lowry法測定蛋白質(zhì)含量［2］。以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標(biāo)， 中性紅比色法測得的D值和蛋白質(zhì)含量為縱坐標(biāo)， 分別繪制細(xì)胞生長曲線和蛋白質(zhì)變化曲線。
1.4 胞內(nèi)游離鈣濃度測定
細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的測定按文獻(xiàn)［3］方法進行。
1.5 cAMP濃度測定
于100 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)接種RAW264.7細(xì)胞， 待細(xì)胞生長接近匯合時給予不同濃度β葡聚糖刺激， 分別于刺激后1，5和15 min 3個時間點取樣。取樣時棄培養(yǎng)液， 立即向瓶內(nèi)加入1 ml 預(yù)冷的0.24 mol/L 高氯酸溶液， 用橡皮刮收集細(xì)胞，冰浴下超聲破碎細(xì)胞， 離心取上清， 以KOH中和至pH 6.3左右， 去除沉淀的高氯酸鉀， 取上清液冷凍干燥后于-20℃保存?zhèn)溆?。cAMP濃度測定按試劑盒(上海中醫(yī)藥大學(xué))說明書進行。
1.6 數(shù)據(jù)處理
實驗結(jié)果用±s表示， 以方差分析作統(tǒng)計學(xué)處理。
2 結(jié) 果
2.1 β葡聚糖對RAW264.7細(xì)胞生長的影響
在相差顯微鏡下觀察， β葡聚糖對RAW264.7細(xì)胞形態(tài)無明顯影響。對生長曲線和培養(yǎng)液內(nèi)蛋白質(zhì)含量的作用均呈雙相性(圖1，圖2)。低濃度β葡聚糖對RAW264.7細(xì)胞具有促進作用， 隨著β葡聚糖濃度的逐漸增大， D值也不斷升高， 至β葡聚糖濃度100 μg/ml時達(dá)最高峰， 與對照組(不加β葡聚糖)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P
2.2 β葡聚糖對RAW264.7細(xì)胞游離鈣的影響
加入β葡聚糖刺激后胞內(nèi)游離鈣迅速上升， 在5 min時反應(yīng)達(dá)高峰， 游離鈣上升幅度與β葡聚糖濃度有關(guān)(圖3)。以EGTA螯合培養(yǎng)環(huán)境中鈣離子的結(jié)果顯示，細(xì)胞外鈣離子存在與否對β葡聚糖刺激引起的細(xì)胞游離鈣波動有明顯影響(圖4)。提示升高的游離鈣來自細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流。
2.3 β葡聚糖對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的影響
β葡聚糖刺激1 min時細(xì)胞內(nèi)cAMP明顯增高(P
3 討 論
巨噬細(xì)胞是機體免疫系統(tǒng)專職吞噬細(xì)胞之一，源自血液單核細(xì)胞，廣泛分布于所有組織中，成為機體抗入侵微生物的第一道防線，在機體抗真菌感染中也起著重要作用。它通過免疫球蛋白受體和補體受體識別并吞噬受調(diào)理素作用的微生物;對于未經(jīng)調(diào)理作用的微生物，則通過一組胚系編碼的蛋白-模式識別受體(PRRs)［4］迅速識別表達(dá)于微生物表面的稱作病原相關(guān)微生物模式（PAMPs)的保守微生物分子，如主要存在于革蘭陰性菌的脂多糖、革蘭陽性菌的磷脂酸以及真菌的葡聚糖等［5］ 。β葡聚糖是真菌細(xì)胞壁含量最高的多糖， 具有廣泛的生物學(xué)效用。已有研究表明， β葡聚糖可促進多種細(xì)胞活化［6］。我們注意到微量β葡聚糖雖可促進RAW264.7細(xì)胞增生， 但對細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)無明顯作用。通過對細(xì)胞內(nèi)第二信使傳遞系統(tǒng)的觀察發(fā)現(xiàn)，β葡聚糖可明顯增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣和cAMP。胞內(nèi)游離鈣和cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的信使分子， 介導(dǎo)許多重要的生理功能。通過觀察細(xì)胞游離鈣和cAMP的變化， 可以了解β葡聚糖信號在靶細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo)機制。
本實驗結(jié)果表明，β葡聚糖刺激可在2～5 min內(nèi)使細(xì)胞內(nèi)游離鈣迅速升高， 而且在一定范圍內(nèi)其上升幅度與β葡聚糖劑量相關(guān)。細(xì)胞外Ca2+存在與否對β葡聚糖刺激后胞內(nèi)游離鈣波動有明顯影響， 提示胞內(nèi)游離鈣的升高主要來源于細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流而非細(xì)胞內(nèi)鈣庫的動員。β葡聚糖使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高是否與β葡聚糖促細(xì)胞增生作用有關(guān)， 尚有待進一步研究， 但我們的實驗結(jié)果提示， cAMP含量變化與細(xì)胞蛋白合成的量相關(guān)。
參考文獻(xiàn)
［1］ 聞 平， 何 艷， 葉慶林， 等.中性紅比色法檢測細(xì)胞增殖活性［J］.鎮(zhèn)江醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2000， 10 (1): 161-163.
［2］ Lowry OH，Rosebrough NJ，F(xiàn)arr AL，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent ［J］.J Biol Chem， 1951，193(1): 265-275.
［3］ Ye QL，Wagner M，Smythe S，et al.Thyrotrophin， but not forskolin， increases intracellular free calcium and calmodulin in pig thyroid cells［J］.J Endocrinol， 1991， 129(2): 291-299.
［4］ Diniz SN， Nomizo R， Cisalpino PS， et al.PTX3 function as an opsonin for the dectin1dependent internalization of zymosan by macrophages［J］.J Leukoc Biol， 2004， 75 (4): 649-656.
篇7
作者：王燕 鄧正照 郭艷紅 于海奕 高煒
【摘要】 目的： 探討晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products， AGE)及葡萄糖對THP1巨噬細(xì)胞CXCL16 mRNA表達(dá)的影響. 方法： ①選擇合適的培養(yǎng)時間；②不同濃度的AGE與THP1巨噬細(xì)胞共同孵育；③不同濃度葡萄糖與THP1巨噬細(xì)胞共同孵育；分別用AGE、葡萄糖及同時加入AGE和葡萄糖與THP1巨噬細(xì)胞孵育；⑤采用RTPCR檢測孵育后CXCL16及CD36mRNA的表達(dá)量，觀察和比較各組孵育后CXCL16及CD36 mRNA的表達(dá)情況. 結(jié)果： ①隨著培養(yǎng)液中AGE濃度的增加CXCL16及CD36 mRNA的表達(dá)增加；②隨培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的增加CXCL16及CD36 mRNA的表達(dá)增加；③AGE及葡萄糖同時作用于THP1巨噬細(xì)胞時，對CXCL16及CD36 mRNA的表達(dá)上調(diào)作用大于AGE或葡萄糖單一因素的影響. 結(jié)論： AGE及葡萄糖呈時間和濃度依賴性上調(diào)THP1巨噬細(xì)胞CXCL16 mRNA的表達(dá)，并且AGE及葡萄糖兩者合用可以進一步增加這種表達(dá). 這可能為糖尿病動脈粥樣硬化機制的探討提供新的線索.
【關(guān)鍵詞】 CXCL16；糖基化終產(chǎn)物，高級；葡萄糖；糖尿病
0引言
結(jié)合磷脂酰絲氨酸和氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein， oxLDL）的清道夫受體（scavenger receptor for phosphatidylserine and oxidized lipoprotein， SRPSOX)是一種新發(fā)現(xiàn)的清道夫受體， 克隆分析證實其在分子結(jié)構(gòu)上與趨化因子CXCL16是同一分子［1］. 作為清道夫受體，CXCL16可以介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬oxLDL，形成泡沫細(xì)胞，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生. 作為趨化因子，它可以參與炎癥細(xì)胞的趨化及炎癥細(xì)胞間的相互作用［2］. CXCL16的這種雙重作用增強了炎癥與動脈粥樣硬化間的直接聯(lián)系，也預(yù)示其在動脈粥樣硬化性疾病中的重要作用. 多種炎性刺激因子如脂多糖、白介素18、干擾素γ及腫瘤壞死因子α等可使巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的CXCL16表達(dá)增加 ［3］，同時也有報道AGE及高葡萄糖對其他清道夫受體如CD36的表達(dá)有上調(diào)作用［4-5］，但AGE或高葡萄糖是否影響CXCL16的表達(dá)國內(nèi)外少見報道. 我們通過研究AGE及高葡萄糖對巨噬細(xì)胞表達(dá)CXCL16的影響，同時對AGE及高葡萄糖上調(diào)巨噬細(xì)胞表達(dá)CD36的作用加以驗證，為糖尿病動脈粥樣硬化并發(fā)癥的發(fā)病機制的探討提供新的線索.
1材料和方法
1.1材料佛波酯（PMA）、AGE購自美國Sigma 公司；葡萄糖購自北京泛基諾科技有限公司；TRIzol及其它RNA提取試劑為Gibco公司產(chǎn)品；所有引物由上海生工公司合成；cDNA 合成酶（MMLV）及Taq酶購自北京天為時代公司；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純.
1.2方法
1.2.1THP1細(xì)胞株培養(yǎng)人單核細(xì)胞系THP1株購于中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞中心. THP1細(xì)胞生長于含有低糖（5.6 mmol/L），100 mL/L 胎牛血清，10 mmol/L HEPES，1×105 U /L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640 完全培養(yǎng)基中，置于37℃，50 mL/L CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).
1.2.2實驗分組取對數(shù)生長期THP1細(xì)胞（1×106個/皿）進行實驗，每次實驗前用100 nmol/L PMA孵育THP1細(xì)胞48 h，使其誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞［6］. ①單獨AGE處理組：首先確定合適的培養(yǎng)時間，即用100 mg/L AGE與THP1巨噬細(xì)胞孵育不同時間（0，6，12，24，48，72 h），根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果，選擇72 h為合適孵育時間，不同濃度的AGE（ 0，50，100，150 mg/L）與THP1巨噬細(xì)胞共同孵育72 h；②單獨葡萄糖處理組：用高濃度葡萄糖培養(yǎng)液（30 mmol/L）與THP1巨噬細(xì)胞孵育不同時間（ 0，6，12，24，48，72，96 h），確定72 h為合適培養(yǎng)時間后，用不同濃度葡萄糖（5.6，10，20，30 mmol/L）與THP1巨噬細(xì)胞共同孵育72 h；③AGE和葡萄糖聯(lián)合作用組：分別用AGE(100 mg/L)、高濃度葡萄糖（20 mmol/L）及同時加入AGE(100 mg/L)和葡萄糖（20 mmol/L）與THP 1巨噬細(xì)胞孵育72 h.
1.2.3逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈反應(yīng)檢測CXCL16及CD36 mRNA的表達(dá)TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，cDNA反應(yīng)總體系為20 μL：10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.1 mol/L DTT 1 μL，500 mg/L Random primer 0.25 μL，6.7×108 nkat/L RNasin 0.5 μL， 3.3×107 nkat/L MMLV 1 μL，5×緩沖液2.0 μL. 以cDNA為模板，分別使用下述3對引物進行PCR，擴增CXCL16基因的引物序列為：上游5′ACTCAGCCAGGCAATGGCAAC 3′，下游5′GGTATTAGAGTCAGGTGCCAC 3′，擴增片段長度為693 bp. 擴增CD36基因的引物序列為：上游5′CTCCCAAAGTGCTGGGATTA 3′，下游5′AGCCTTTGGGGGTCTTTCTA 3′，擴增片段長度為246 bp. 擴增內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因的引物序列為：上游5′CTGGTCACCAGGGCTGCTTTT 3′，下游5′CATGAGGTCCACCACCCTGTT3′，擴增片段長度為936 bp. PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min 預(yù)變性，95℃ 30 s 變性，60℃ 30 s 退火，72℃ 30 s延伸，30 個循環(huán)，72℃ 繼續(xù)延伸10 min. PCR反應(yīng)總體系為20 μL： 無RNA酶水14.75 μL，10×緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL， 100 g/L引物各1μL，8.3×107 nkat/L Taq酶0.25 μL，cDNA模板1 μL.
1.2.4RT PCR產(chǎn)物檢測及半定量分析反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠恒壓80 V電泳30 min， 溴化乙錠染色. 利用紫外投射分析儀對電泳結(jié)果進行觀察并拍照. 運用軟件SynGene Tools Analysis Software對PCR電泳結(jié)果進行灰度值掃描并半定量分析. 每例樣品的CXCL16和CD36基因PCR產(chǎn)物的灰度值分別除以它們相應(yīng)的內(nèi)參GADPH基因PCR產(chǎn)物的灰度值， 從而得到上述兩種受體基因mRNA的相對表達(dá)水平.
統(tǒng)計學(xué)處理：由SPSS13.0 統(tǒng)計軟件完成，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用StudentNewmanKeuls (q) 檢驗，P
2結(jié)果
2.1AGE作用于THP1巨噬細(xì)胞不同時間對CXCL16，CD36mRNA表達(dá)的影響THP1巨噬細(xì)胞與100 mg/L AGE孵育不同時間（ 0，6， 12，24，48，72 h），RTPCR 檢測THP1巨噬細(xì)胞CXCL16及CD36 mRNA的表達(dá). 隨著孵育時間的延長，THP1巨噬細(xì)胞中CXCL16及CD36 mRNA的表達(dá)上調(diào)，孵育72 h CXCL16及CD36 mRNA表達(dá)與孵育0 h相比上調(diào)最明顯（P
圖1AGE作用于THP1巨噬細(xì)胞不同時間對CXCL16，CD36 mRNA表達(dá)的影響(n=4)
2.2不同濃度AGE對THP1巨噬細(xì)胞中CXCL16，CD36 mRNA表達(dá)的影響THP1巨噬細(xì)胞與不同濃度AGE（ 0，50，100，150 mg/L）孵育72 h后，RT PCR檢測THP1巨噬細(xì)胞中CXCL16及CD36 mRNA的表達(dá). 各濃度組CXCL16 mRNA的表達(dá)除在50 mg/L組與未加刺激因素的對照組（0 mg/L組）之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）之外，其他各組之間的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P
aP
圖2不同濃度AGE對THP 1巨噬細(xì)胞CXCL16，CD36 mRNA表達(dá)的影響
2.3葡萄糖作用于THP1巨噬細(xì)胞不同時間對CXCL16，CD36mRNA表達(dá)的影響THP1巨噬細(xì)胞用30 mmol/L的高濃度葡萄糖培養(yǎng)液孵育不同時間（0，6，12，24，48，72，96 h），RTPCR檢測THP1巨噬細(xì)胞CXCL16，CD36 mRNA的表達(dá). 隨培養(yǎng)時間的延長，THP1巨噬細(xì)胞CXCL16，CD36 mRNA的表達(dá)上調(diào)，與孵育0 h相比，孵育72 h時THP1巨噬細(xì)胞CXCL16，CD36 mRNA的表達(dá)上調(diào)最明顯（P
2.4不同葡萄糖濃度對THP1巨噬細(xì)胞CXCL16，CD36 mRNA表達(dá)的影響THP 1巨噬細(xì)胞與不同葡萄糖濃度（5.6，10，20，30 mmol/L）培養(yǎng)液孵育72 h后，RT PCR檢測THP1巨噬細(xì)胞CXCL16，CD36 mRNA的表達(dá). CXCL16 mRNA的表達(dá)除在20 mmol/L組與30 mmol/L組之間的差異無顯著性（P>0.05）之外，其他各組之間的差異均具有顯著性(P
圖3葡萄糖作用于THP 1巨噬細(xì)胞不同時間對CXCL16，CD36 mRNA表達(dá)的影響(n=4)
aP
圖4不同葡萄糖濃度對THP 1巨噬細(xì)胞CXCL16，CD36 mRNA表達(dá)的影響
2.5AGE和葡萄糖同時作用于THP1巨噬細(xì)胞對CXCL16，CD36mRNA 表達(dá)的影響THP1巨噬細(xì)胞分別與葡萄糖（20 mmol/L）、AGE(100 mg/L)、同時加入葡萄糖（20 mmol/L）和AGE(100 mg/L)孵育72 h，RTPCR檢測THP1巨噬細(xì)胞CXCL16，CD36 mRNA的表達(dá). 高葡萄糖和AGE分別作用于THP1巨噬細(xì)胞時均可使CXCL16，CD36 mRNA表達(dá)上調(diào). 二者同時作用時THP 1巨噬細(xì)胞CXCL16，CD36 mRNA表達(dá)上調(diào)的程度大于單一因素的作用（P
3討論
CXCL16是一種新發(fā)現(xiàn)的清道夫受體，表達(dá)在巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞上. 它是繼CX3CL1之后發(fā)現(xiàn)的第二個既能以膜結(jié)合形式存在又能以分泌型的可溶性分子存在的趨化因子. 以膜結(jié)合的形式存在時，CXCL16發(fā)揮清道夫受體的功能，結(jié)合并吞噬磷脂酰絲氨酸包被的顆粒如凋亡小體和oxLDL ［7］. 在金屬蛋白酶10(metalloproteinase 10)的水解作用下CXCL16的細(xì)胞膜外部分脫離細(xì)胞膜表面成為游離的分子，發(fā)揮趨化因子的功能［8-9］.
我們的實驗結(jié)果表明AGE和高葡萄糖對THP1巨噬細(xì)胞CXCL16 mRNA的表達(dá)有上調(diào)作用，且二者共同作用可使CXCL16 mRNA表達(dá)進一步增加. 是否影響蛋白的表達(dá)（包括膜結(jié)合形式和分泌形式）還需要進一步的研究. 我們同時觀察了AGE和高葡萄糖對CD36 mRNA的表達(dá)，結(jié)果與文獻(xiàn)報道的結(jié)果基本是一致的，能夠上調(diào)CD36 mRNA的表達(dá)［4-5］. 已有研究證明巨噬細(xì)胞CXCL16表達(dá)的增加促進了對oxLDL的吞噬和泡沫細(xì)胞的形成，組化分析也表明CXCL16主要表達(dá)在動脈粥樣硬化的斑塊處，而無動脈粥樣硬化斑塊的血管未見有表達(dá)［10］. 由此可見AGE和高葡萄糖能夠刺激巨噬細(xì)胞CXCL16表達(dá)的增加，對解釋糖尿病患者過高的動脈粥樣硬化疾病危險性有重要意義.
AGE及高葡萄糖促進CXCL16mRNA表達(dá)的機制尚不清楚. AGE可以上調(diào)多個清道夫受體的表達(dá)，包括清道夫受體A、清道夫受體B1，CD36和血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1（ lectinlike oxidized lowdensity lipoprotein receptor1，LOX1，對不同受體AGE調(diào)控機制不同. 就CD36來說，AGE與其特異性受體（晚期糖基化終末產(chǎn)物受體）結(jié)合，通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ而促進CD36的表達(dá)［4］. 高葡萄糖對CD36表達(dá)的上調(diào)作用可能是通過影響巨噬細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激張力，增加脂質(zhì)過氧化實現(xiàn)的［5］. 高葡萄糖也可以上調(diào)LOX1的表達(dá)，可能的機制是高葡萄糖增加細(xì)胞內(nèi)活性氧基，啟動蛋白激酶C/促分裂原活化蛋白激酶通路，最后通過激活核因子κB和活化蛋白1上調(diào) LOX1的表達(dá)［11］. 本研究發(fā)現(xiàn)AGE和高葡萄糖同時刺激THP1巨噬細(xì)胞時，使CXCL16，CD36mRNA表達(dá)上調(diào)的程度大于兩種因素單獨作用也提示AGE和高葡萄糖可能是通過不同的作用機制上調(diào)THP1巨噬細(xì)胞CXCL16，CD36 mRNA的表達(dá).
參考文獻(xiàn)
［1］ Shimaoka T， Kume N， Minami M， et al.Molecular cloning of a novel scavenger receptor for oxidized low density lipoprotein， SRPSOX， on macrophages ［J］. J Biol Chem， 2000，275 : 40663-40666. ［2］ Ludwig A， Weber C. Transmembrane chemokines: versatile‘special agents’in vascular inflammation［J］. Thromb Haemost， 2007，97:694-703.
［3］ Wilbanks A， Zondlo SC， Murphy K， et al. Expression cloning of the STRL33/BONZO/TYMSTR ligand reveals elements of CC， CXC， and CX3C chemokines ［J］.J Immunol，2001，166:5145-5154.
［4］ Yasunori I， Masaaki E， Akira H， et al. Advanced glycation end products induced gene expression of scavenger receptors in cultured human monocytederived macrophage［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2000，277:368-380.
［5］ Tony H， Khitam H， Michael A，et al. Macrophagefoam cell formation in streptozotocininduced diabetic mice: Stimulatory effect of glucose ［J］.Atherosclerosis， 2005，183:25-33.
［6］ Kosaka C， Masuda J， Shimokado K， et al. Interferongamma suppresses PDGF production from THP1 cells and blood monocytederived macrophages［J］. Atherosclerosis，1992， 97:75-87.
［7］ Minami M， Kume N， Shimaoka T， et al. Expression of SRPSOX， a novel cellsurface scavenger receptor for phosphatidylserine and oxidized LDL in human atherosclerotic lesions［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2001， 21:1796-1800.
［8］ Schulte A， Schulz B， Andrzejewski MG， et al. Sequential processing of the transmembrane chemokines CX3CL1 and CXCL16 by alpha and gammasecretases［J］. Biochem Biophys Res Commun，2007，358:233-240.
［9］ Hundhausen C， Schulte A， Schulz B， et al. Regulated shedding of transmembrane chemokines by the disintegrin and metalloproteinase 10 facilitates detachment of adherent leukocytes［J］. J Immunol，2007，178:8064-8072.
篇8
摘要：目的探討二至丸免疫調(diào)節(jié)作用的活性組分構(gòu)件。方法運用中藥復(fù)方組合化學(xué)、血清藥理學(xué)和細(xì)胞藥理學(xué)方法，觀察女貞子、墨旱蓮系列提取物及其組合物對小鼠淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用。結(jié)果女貞子乙醇提取物、墨旱蓮乙醇提取物、女貞子乙醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（1∶1）具有較強的絲裂原樣作用，可以促進小鼠外周血、脾淋巴細(xì)胞增殖和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。結(jié)論二至丸對小鼠淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作用的活性組分構(gòu)件是女貞子乙醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（1∶1）。
關(guān)鍵詞：二至丸； 中藥復(fù)方組合化學(xué)； 血清藥理學(xué)； 細(xì)胞藥理學(xué)； 免疫調(diào)節(jié)； 活性組分構(gòu)件
Study of Active Components with Immunoregulation from Erzhi Pill on Lymphocytes and Macrophages in Mice
Abstract：ObjectiveTo study the active components with immunoregulation from Erzhi Pill.MethodsDifferent extractions were extracted from Ligustrum lucidum Ait.（LLA）or Eclipta prostrata L.（EPL） with different solvents such as water，alcohol etc.The effect on lymphocytes and macrophages in mice was observed with the methods of Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions， blood serum pharmacology and cytopharmacology.ResultsDifferent extraction showed different effects on mice lymphocytes and macrophages in vitro.The alcohol extraction from LLA (NYC)，the alcohol extraction from EPL (HYC) or both (1∶1) could stimulate the mouse lymphocytes proliferation of peripheral blood and spleen and enhance the phagocyteses of mice macrophages.ConclusionThe active components with immunoregulation from Erzhi Pill on lymphocytes and macrophages in mice was the mixture of NYC and HYC (1∶1).
Key words：Erzhi Pill;
Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions; Blood serum pharmacology; Cytopharmacology; Immunoregulation; Active components
二至丸是中醫(yī)臨床的經(jīng)典名方，《醫(yī)便》（明?王三才）記載：“二至丸，清上補下第一方，價廉而功極大?！保?］它由女貞子、墨旱蓮各等份組成，組方簡單，藥性平和，功效確切，作為補益肝腎良藥。數(shù)百年來，倍受歷代醫(yī)家推崇?，F(xiàn)代還用于衰老、神經(jīng)衰弱、疲勞綜合癥及更年期綜合癥等疾病的治療。中成藥二至丸先后被歷版《中國藥典》（Ⅰ部）和“第二批國家非處方藥目錄”收載。一些學(xué)者相繼從現(xiàn)代藥理學(xué)角度對其進行了研究，證明二至丸對機體免疫功能具有多方面的調(diào)節(jié)作用，但研究中多以水煎劑、女貞子多糖及方中單味藥提取物給藥［2～5］。由于目前對其復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機理還缺乏系統(tǒng)規(guī)范的研究，致使制劑工藝粗放，日用劑量過大［6］，劑型落后，不符合現(xiàn)代中藥要求，影響了它的公眾認(rèn)知度。作者在遵從復(fù)方配伍規(guī)律的前提下，以活性評價為導(dǎo)向，運用中藥復(fù)方組合化學(xué)、血清藥理學(xué)和細(xì)胞藥理學(xué)方法，對其免疫調(diào)節(jié)作用的有效組分構(gòu)件進行探討，以期進一步組成精簡方劑，從而為二至丸的二次開發(fā)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)實驗數(shù)據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動物普通級 KM種小鼠，8周齡，體重22～24 g，購于重慶市中藥研究院實驗動物研究室（許可證號：310101001）。
1.1.2 試劑RPMIl640培養(yǎng)液 (Gibco產(chǎn)品)、無酚紅 RPMIl640培養(yǎng)液 (Sigma產(chǎn)品)，配制時加青霉素1×105 IU/L、鏈霉素100 mg/L，過濾，使用時加體積分?jǐn)?shù)為15% 的胎牛血清（FBS，超級，杭州四季青生物工程材料研究所）。ConA(刀豆蛋白A)，F(xiàn)luka產(chǎn)品；LPS(脂多糖)，Sigma產(chǎn)品，用 RPMI1640配成1 mg/ml，0.22 μm過濾，分裝，20℃凍存，臨用前稀釋。MTT(噻唑藍(lán))，Sigma產(chǎn)品，使用前用 PBS配制成5 mg/ml，過濾，4℃避光保存。硫代羥基乙酸鈉 (thioglyc011ate，TG)，北京生物制品所產(chǎn)品。其余試劑均為市售分析純。
1.1.3 儀器Napco6lOO型CO2培養(yǎng)箱，美國。96孔板，Nunclon，丹麥。微量可調(diào)加樣器，Labsystems，芬蘭。多頭細(xì)胞收集儀，ZTⅢ型，上海醫(yī)科大學(xué)。550型酶標(biāo)儀，BioRad，美國。恒溫水浴搖床，Yamato，日本。
1.1.4 藥物女貞子 Ligustrum lucidum Ait.（LLA）、墨旱蓮 E clipta prostrata L.（EPL），購于重慶市中藥材公司，符合《中國藥典》2005年版Ⅰ部規(guī)定。
1.2 方法
1.2.1 女貞子、墨旱蓮提取物的制備取女貞子或墨旱蓮藥材，粉碎，過20目篩，依次用不同溶劑，10倍量提取2次，2 h/次，過濾，合并提取液，回收溶劑，制備女貞子或墨旱蓮的石油醚提取物（簡稱 NSYM或 HSYM）、醋酸乙酯提取物（簡稱 NYSYZ或 HYSYZ）、乙醇提取物（簡稱 NYC或 HYC）和水煎煮提取物（簡稱 NSJZ或 HSJZ）。臨用前，分別用生理鹽水（NS）制備藥液，必要時可加少量 Tween80助溶，濃度相當(dāng)于1 mg生藥/ml。
1.2.2 含藥血清的制備［7］小鼠按體重隨機分組，每組10只，雌、雄各半。ig給藥，給藥2次，間隔2 h。ig容積10 ml/kg，空白血清組ig NS，各含藥血清組 ig相應(yīng)組分6.7 g生藥 /kg（組合組分13.4 g生藥 /kg）。末次給藥1 h，深度麻醉，心臟無菌采血，3000 r/min離心10 min，收集血清。同組分血清混合，56℃水浴30 min，-20℃凍存，臨用前4℃凍融。
1.2.3 細(xì)胞懸液的制備［8］小鼠腹腔注射3% TG溶液（2 ml/只），72h后眼眶采血（肝素500 IU/ml抗凝），隨即脫頸椎處死小鼠，ip PBS 5ml，收集腹腔洗液，同時無菌取脾。常規(guī)方法制備細(xì)胞懸液，PBS液洗滌，離心，細(xì)胞沉淀加入 RPMI164010% FBS培養(yǎng)液，調(diào)整濃度為2×106 cells/ml，臺盼蘭排除法檢查細(xì)胞存活率大于95%。
1.2.4 淋巴細(xì)胞增殖（lymphocytes proliferation，LP）實驗［9］96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各給藥組每孔加入50μl淋巴細(xì)胞懸液、20 μl含藥血清和120 μl RPMI164010%FBS培養(yǎng)液（對照組、刺激組分別用20 μl空白血清），混勻后預(yù)孵1 h，再加入10 μl ConA或 LPS（終濃度為5 μg/ml）刺激（對照組用10 μl PBS），各設(shè)8個復(fù)孔。5% CO2培養(yǎng)箱（Forma.USA）37℃培養(yǎng)48 h后，加入 MTT 10 μl/孔（10 mg/ml）培養(yǎng)8 h，棄上清，加入 DMSO 100 μl/孔，MTT結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀570 nm處測定A值。
1.2.5 腹腔巨噬細(xì)胞（PMф）吞噬活性實驗［10］96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各給藥組每孔加入50 μl腹腔巨噬細(xì)胞懸液、20 μl含藥血清和120 μl無酚紅 RPMI164010% FBS培養(yǎng)液（對照組用20 μl空白血清），各設(shè)8個復(fù)孔。5% CO2培養(yǎng)箱（Forma.USA）37℃培養(yǎng)24 h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加0.075%中性紅溶液100 μl/孔，培養(yǎng)1 h，棄上清液，預(yù)溫的 PBS液洗3遍，加入細(xì)胞溶解液（0.1 mol/L乙酸：無水乙醇）100 μl/孔，室溫放置，過夜。次日，取上清液于酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀540 nm處測定A值。
1.2.6
統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS11.0統(tǒng)計軟件包。運用單向方差分析（OneWay ANOVA），選用 Dunnett法進行組間顯著性分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示。
2 結(jié)果
2.1
女貞子或墨旱蓮提取物對小鼠 LP和PMφ活性的影響結(jié)果見表1。
表1 女貞子或墨旱蓮提取物對小鼠 LP和PMφ活性的影響（略）
與正常對照組比較，1）P＜0.01，2) P＜0.05；與刺激劑組比較，3) P＜0.01，4) P＜0.05；刺激劑指刀豆蛋白 A或脂多糖從表1可以看出，女貞子或墨旱蓮提取物對 ConA或 LPS誘導(dǎo)的小鼠外周血和脾淋巴細(xì)胞增殖、對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性均有較明顯的促進作用。強度順序依次為，NYC＞NYSYZ＞NSJZ＞NSYM；HYC＞HYSYZ＞HSJZ＞HSYM。提示，女貞子或墨旱蓮促進小鼠LP和PMф活性作用最強的組分分別是 NYC或 HYC，即女貞子乙醇提取物或墨旱蓮乙醇提取物。
表2 女貞子墨旱蓮提取物組合對小鼠 LP和PMφ活性的影響（略）
與正常對照組比較，1) P＜0.01，2) P＜0.05；與刺激劑組比較，3) P＜0.01，4) P＜0.05；刺激劑指刀豆蛋白 A或脂多糖
2.2 女貞子墨旱蓮提取物組合對小鼠 LP和 PMφ活性的影響結(jié)果見表2。從表2可以看出，女貞子墨旱蓮不同提取物交叉組合后，對 ConA或 LPS誘導(dǎo)的小鼠外周血和脾淋巴細(xì)胞增殖、對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性均有較明顯的促進作用。強度順序依次為 NYC+HYC＞NYC+HYSYZ＞HYC+NYSYZ＞NYC+HSJZ＞HYC+NSJZ＞NYC+HSYM＞HYC+NSYM。提示，二至丸（女貞子和墨旱蓮的組合復(fù)方）促進小鼠LP和PMφ活性作用最強的組分構(gòu)件是NYC+HYC，即女貞子乙醇提取物和墨旱蓮乙醇提取物。
3 討論
免疫功能低下常常與一些疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，已經(jīng)對人類社會構(gòu)成了巨大威脅。對于疾病、衰老或治療藥物引起的免疫功能低下，現(xiàn)代慣用生物制劑，如胸腺素、轉(zhuǎn)移因子、干擾素等，或化學(xué)制劑如左旋咪唑等，增強細(xì)胞免疫功能，但這些藥物容易引起發(fā)熱、嘔吐、粒細(xì)胞減少及肝腎功能異常等不良反應(yīng)，而中藥在這方面具有獨特的優(yōu)勢［11］。在人用疫苗佐劑相對缺乏、人們?nèi)找孀⒅馗纳粕|(zhì)量的今天，具有高活性免疫調(diào)節(jié)作用的中藥有效成分被認(rèn)為是理想的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑［12］。近年來通過臨床或?qū)嶒炑芯堪l(fā)現(xiàn)四君子湯、生脈散、六味地黃丸、當(dāng)歸補血湯、腎氣丸等補益方劑有很強的免疫調(diào)節(jié)作用，二至丸在改善機體免疫功能方面療效顯著［13］。目前國內(nèi)對六味地黃丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機理研究較為深入，相繼研制成功了六味地黃口服液、膠囊、軟膠囊及滴丸等新劑型，取得了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益，而對二至丸的相關(guān)研究卻極為薄弱。中藥復(fù)方本身的分子多樣性決定了其“有用分子”不明確，無用或誘發(fā)毒副作用的分子占絕大多數(shù)，從而表現(xiàn)出多成分、多途徑、多靶點的作用特點，這在客觀上增加了中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機理研究的難度。目前，關(guān)于其方法學(xué)研究，觀點和構(gòu)思較多，如三元設(shè)計方案、霰彈理論、血清藥理學(xué)及天然組合化學(xué)庫與多靶作用機理等［14］，對于實際工作具有一定的啟發(fā)和參考價值。作者在實際研究工作中發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方組合化學(xué)方法在中藥復(fù)方活性成分群研究中具有明顯的優(yōu)勢。該方法借鑒現(xiàn)代藥學(xué)組合化學(xué)研究方法，選擇能代表方劑主治病癥病理生理和治則的藥理學(xué)指標(biāo)，通過組分或單體成分的組合，采用排除篩選法，找出其活性最強的組份構(gòu)件，即確定“有用分子”組合的精簡方劑［15］。它與直接測定成分法不同，既可充分體現(xiàn)中藥復(fù)方多組分協(xié)同的特點，又可簡化中藥復(fù)方的分子多樣性，符合中醫(yī)藥整體觀和辯證分析的理論精髓?？紤]到二至丸原方及其中成藥均采用方中藥味單獨處理后再組合制劑的工藝路線，故本文運用中藥復(fù)方組合化學(xué)方法進行活性部位研究。本研究結(jié)果表明，女貞子乙醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（1∶1）是二至丸復(fù)方最強的免疫調(diào)節(jié)作用活性部位，能夠協(xié)同LPS、ConA等有絲分裂原誘導(dǎo)的小鼠外周血、脾淋巴細(xì)胞增殖，升高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性。提示這些組分均能激活T細(xì)胞及B細(xì)胞，具有絲裂原樣作用，可以增強腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。據(jù)此推測，女貞子、墨旱蓮以水做溶媒提取活性成分可能提取不充分，故二至煎劑的藥理作用還不能完全反映二至丸的藥理作用，因此古代醫(yī)家用二至丸而不用二至湯。隨著對上述組分的進一步分離、純化及其作用機理的闡明，獲得由有效成分組成的精簡方劑將成為現(xiàn)實，無疑會為現(xiàn)代中藥的研究注入新的內(nèi)容。
參考文獻(xiàn)
［1］ 操紅纓，梁頌名，榮向路，等．二至丸對陰虛模型神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用的研究［J］.中藥材，2000，23（2）：166.
［2］ 段曉春．旱蓮草的研究概況［J］.中國臨床醫(yī)藥實用雜志，2004，(12)：59.
［3］ 李葆華．女貞子的研究狀況［J］.中華醫(yī)學(xué)研究與實踐，2004，2(7)：49.
［4］ 李磷，丁安偉，孟麗．二至丸免疫調(diào)節(jié)作用活性部位的研究［J］.中醫(yī)藥研究，2002；18(5)：42.
［5］ 劉大基，劉解生，徐繼勛，等．二至丸對小鼠淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用［J］.湖北中醫(yī)雜志，2002，24(2)：48 .
［6］ 國家藥典委員會．中國藥典，Ⅰ部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：293.
［7］ 姚干，彭成，周東，等．大川芎方對神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷的保護作用［M］．中成藥，2004，26（4）：315.
［8］ 路景濤，楊雁，陳敏珠．黃芪多糖對細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNFα、NO及IL1的影響［J］．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，39(2)：140.
［9］ 徐建芬，陳學(xué)群，杜繼曾．間斷性低氧對大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響［J］．中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2005，21(1)：5.
［10］ 梁文杰，劉東青，單保恩，等．北豆根提取物對小鼠和人淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞作用的體外實驗研究［J］．中國免疫學(xué)雜志，2005，21(1)：56.
［11］ 周麗娟，許利平．中藥抗炎免疫藥理免疫調(diào)節(jié)研究進展［J］．中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2004，10（1）：79.
［12］ 祝 崢，胡云章，錢子剛．補益類中藥有效成分作為新型人用疫苗佐劑的應(yīng)用前景［J］．生物技術(shù)通訊，2004，15（1）：92.
［13］ 沈映君．中醫(yī)藥學(xué)高級叢書?中藥藥理學(xué)，第1版［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：988.
篇9
[關(guān)鍵詞]壓力性潰瘍；rhGM-CSF；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子
[中圖分類號]R62 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）04-0332-04
壓瘡是臨床常見的并發(fā)癥之一，壓瘡一旦發(fā)生，不僅會給患者帶來新的痛苦，若繼發(fā)感染還會加重病情導(dǎo)致死亡。隨著基因工程的進步，重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（recombinant human GM-CSF，rhGM-CSF）在創(chuàng)面修復(fù)中得到越來越廣泛的應(yīng)用。rhGM-CSF是一種多功能細(xì)胞因子，已證實在皮膚組織的創(chuàng)面愈合中發(fā)揮著重要作用[1]。我院自2011年2月開始，應(yīng)用rhGM-CSF凝膠治療護理Ⅱ～Ⅲ期壓瘡患者，效果滿意，現(xiàn)報道如下。
1 資料和方法
1.1 一般資料：選擇2011年2月～2013年2月入我院治療的壓瘡患者，按照美國國家壓瘡咨詢工作組（National Pressure Ulcer Advisory Panel，NPUAP）2007壓瘡分級標(biāo)準(zhǔn)[2]，入選Ⅱ～Ⅲ期壓瘡。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲，患者或家屬有治療愿望。排除標(biāo)準(zhǔn)：①最近3個月內(nèi)參加過其他新藥臨床試驗；②過敏體質(zhì)者及對藥物成分過敏者；③孕婦及哺乳期婦女；④糖尿病及全身嚴(yán)重感染患者。共計入選85例（98處）Ⅱ～Ⅲ期壓瘡。其中男性54例（66處），女性31例（32處）。Ⅱ期壓瘡54處，Ⅲ期壓瘡44處。年齡18～72歲，平均（53.64±15.80）。壓瘡存在的時間為（58.64±43.68）天。壓瘡面積（22.9±7.0）cm2。將患者隨機分為試驗組47例（57處）和對照組38例（41處），兩組患者基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 創(chuàng)面處理：操作者為取得資質(zhì)的造口治療師，統(tǒng)一專門培訓(xùn)操作方法及評估標(biāo)準(zhǔn)。處理創(chuàng)面時必須遵守?zé)o菌操作原則，避免二次污染。首先用生理鹽水清洗創(chuàng)面，將壓瘡內(nèi)的壞死組織、膿液及異物徹底清除[3]，再用碘伏涂抹，隨后用生理鹽水棉球擦凈。試驗組采用小紗布將rhGM-CSF凝膠（金扶寧，長春金賽藥業(yè)股份有限公司提供，國藥準(zhǔn)字號：S20100601）搓揉均勻，覆蓋壓瘡創(chuàng)面，對于皮下潛行區(qū)域，將凝膠紗條填塞于間隙內(nèi)，外用無菌干紗加壓包扎，隔天換藥。對照組采用傳統(tǒng)方法，即磺胺嘧啶銀（SD-Ag）霜（鄂藥準(zhǔn)字H20110728），用法同試驗組。
1.2.2 全身干預(yù)：壓瘡以局部受到摩擦力、剪切力和壓力等導(dǎo)致皮膚破損或潰瘍?yōu)橹饕?，同時消瘦、惡液質(zhì)等特殊體質(zhì)也是發(fā)生壓瘡的基礎(chǔ)原因[4]。所以，從患者初診至治療結(jié)束護士均應(yīng)進行全身干預(yù)。內(nèi)容包括：①基礎(chǔ)護理：保持床單位清潔、干燥、平整，囑家屬為患者穿戴透氣性好的純棉衣物，經(jīng)常換洗；②定時翻身：鼓勵和協(xié)助患者每2～3h翻身一次，翻身時采用無張力手法，即將手放到患者身體下受力較大部位向身體正中線方向用力托起患者，取左或右斜30°軸線翻身，防止危險部位皮膚緊繃[5]，③營養(yǎng)支持：糾正貧血及低蛋白血癥，予以高蛋白、高維生素、高熱量、易消化的食物，對不能進食者給予鼻飼，遵醫(yī)囑進行補液、輸血、靜脈滴注高能營養(yǎng)物質(zhì)等支持療法，以增強組織修復(fù)能力；④預(yù)防感染：定時開窗通風(fēng)，保持病室空氣流通，減少人員探視，以防止上呼吸道感染，避免因感冒發(fā)熱使壓瘡迅速擴大或愈后復(fù)發(fā)；⑤心理護理：壓瘡患者通常久治不愈，家屬及本人容易失去信心，為此護理人員應(yīng)對患者表示同情及理解，給予心理疏導(dǎo)及健康宣教，對待患者提出的疑問要耐心一一解答，爭取早日康復(fù)。
1.3 倫理學(xué)研究要求：患者知情同意，并隨機分組，但不告知患者被分入哪一組（單盲）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，征得患者同意并在知情同意書上簽字，昏迷患者由家屬代簽。患者可以隨時退出本研究，并保證其隱私不被泄露。
2 評價指標(biāo)
2.1療效評價：①創(chuàng)面愈合時間：為每處壓瘡從治療開始至愈合所需的時間為愈合時間；②愈合分級：治愈為壓瘡閉合，3%過氧化氫涂抹無泡沫產(chǎn)生；好轉(zhuǎn)指創(chuàng)面減小，部分創(chuàng)面干燥、紅潤，新生肉芽組織長出，炎性滲出液減少；無效為創(chuàng)面無明顯變化，炎性滲出液仍較多。治愈加好轉(zhuǎn)計為總有效。
2.2 傷口內(nèi)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果：分別于換藥前、換藥第7天、換藥第14天戴無菌手套，使用棉棒釆集傷口內(nèi)的分泌物做細(xì)菌培養(yǎng)，有細(xì)菌計為陽性，無細(xì)菌計為陰性。愈合的傷口，按無細(xì)菌感染計算。
2.3 壓瘡愈合評分：采用壓瘡愈合量表（Pressure ulcer scale of healing， PUSH）[6]進行評分。分別于換藥前及換藥第7、14天對創(chuàng)面面積、創(chuàng)面滲液量、壓瘡組織類型3項計分匯總，總分下降為有效，總分上升為惡化，總分無變化為無效，用于綜合評估壓瘡處理各階段的療效。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。
3 統(tǒng)計學(xué)方法
將全部資料錄入SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，服從正態(tài)分布時兩組均數(shù)比較采用配對t檢驗；兩組創(chuàng)面愈合率和療效比較采用Wileoxon秩和檢驗，兩組總有效率的比較采用χ2檢驗；當(dāng)P
4 結(jié)果
4.1療效比較：對照組41處壓瘡中，32處（78.05%）治療有效，試驗組57處壓瘡中，55處（96.49%）治療有效；試驗組總有效率明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P
4.2細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果：換藥前、換藥7天、換藥14天感染細(xì)菌情況比較采用χ2檢驗。換藥前兩組創(chuàng)面感染細(xì)菌情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.932），有可比性；換藥7、14天兩組創(chuàng)面感染細(xì)菌情況比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），見表3。
4.3換藥前及換藥7、14天PUSH評分：兩組患者換藥前PUSH評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），顯示具有可比性；換藥7、14天兩組患者創(chuàng)面PUSH評分差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P
5 討論
從全球范圍來看，壓瘡的發(fā)生率與15年前比較并沒有明顯的下降，預(yù)防和護理壓瘡仍是難題。隨著人口老齡化，慢性疾病患者群體的增多，壓瘡的發(fā)生嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量。Ⅱ期以上壓瘡?fù)ǔ０殡S感染，細(xì)菌可分泌蛋白水解酶分解纖維蛋白，抑制成纖維細(xì)胞等的遷移，故細(xì)菌感染可明顯抑制創(chuàng)面上皮再生[7]。而且，壓瘡患者在治療疾病的過程中，一般都經(jīng)歷過多次換藥及高檔抗生素的應(yīng)用，存在一定程度的耐藥性。因此，理想的壓瘡?fù)庥盟帒?yīng)該具有抗菌譜廣、作用性強、減少滲出、促進上皮生長、無毒性的特點。本研究采用的rhGM-CSF凝膠可增強中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞趨經(jīng)及其活性，參與并且對創(chuàng)面愈合過程中炎癥反應(yīng)環(huán)節(jié)進行調(diào)節(jié)[8]。從本研究可以看出，換藥第7天和14天時，試驗組細(xì)菌清除情況明顯優(yōu)于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明rhGM-CSF相比SD-Ag更具有明顯抗菌優(yōu)勢。
在整個治療過程中，造口治療師采用PUSH計分表跟蹤評分（“直至壓瘡閉合”去掉），從表4結(jié)果可以看出，應(yīng)用rhGM-CSF凝膠治療后，患者7、14天評分呈明顯下降趨勢，遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于SD-Ag組。試驗組有效率為96.49%，對照組有效率為84.93%。試驗組愈合時間為（16.75±1.22）天，對照組為（21.73±4.55）天。以上數(shù)據(jù)綜合顯示rhGM-CSF能促進組織修復(fù)和再生（“減少滲液”去掉），加速傷口愈合。試驗組大部分患者在使用rhGM-CSF治療后的第5～7天，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)新生表皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯角化，后續(xù)觀察也未發(fā)現(xiàn)引起紅腫、過敏等不良反應(yīng)，證實rhGM-CSF在創(chuàng)面修復(fù)中的可靠性和安全性。而且，我們發(fā)現(xiàn)部分患者在使用AD-Ag霜換藥過程中，創(chuàng)面有加深的現(xiàn)象，可能和霜劑在創(chuàng)面上應(yīng)用形成薄痂易導(dǎo)致創(chuàng)面加深有關(guān)。而凝膠制劑不粘連傷口，換藥時患者疼痛感明顯優(yōu)于對照組。
綜上所述，筆者認(rèn)為除積極消除病因，加強翻身，保持皮膚清潔干燥及全身營養(yǎng)支持外，護理人員遵醫(yī)囑采用rhGM-CSF凝膠換藥，能促使壓瘡部位的上皮細(xì)胞在無菌、濕潤的環(huán)境下形成，促進肉芽再生，能達(dá)到加速創(chuàng)面愈合的作用。但對于直徑大于5cm的壓瘡創(chuàng)面，則建議采取手術(shù)植皮治療，這不僅能縮短病程，也利于功能康復(fù)。
[參考文獻(xiàn)]
[1]吳巍巍.外用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子凝膠與金因肽在Ⅱ°燒（燙）傷創(chuàng)面應(yīng)用對比研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2010，19（23）：129-130.
[2]Black J，Baharestani M，Cuddigan J，et al.National pressure ulcer advisory panel's updated pressure ulcer staging system[J].Dermatol Nurs，2007，19：343-349.
[3]馬虹，孫強，田卓民.負(fù)壓封閉引流技術(shù)在42例難治性壓瘡患者中的應(yīng)用[J].中華護理雜志，2010，45（8）：696.
[4]劉艷芳，于鳳蓮，王波.外敷藥物對潰瘍期壓瘡愈合的療效觀察[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2012，21（7）：159.
[5]安靜春.去腐生肌膏聯(lián)合居家護理在壓瘡延續(xù)護理中應(yīng)用的效果評價[J].中國實用護理雜志，2013，29（4）：7.
[6]蔣琪霞，李曉華，胡素琴，等.壓瘡愈合計分對評價壓瘡清創(chuàng)效果的可行性及有效性分析[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2010，23（5）：518-521.
[7]Schierle CF，Dela Garza M，Mustoe TA，et a1.Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelization in a murine cutaneous wound model[J].Wound Rep Regen，2009，17（3）：354-359.
篇10
關(guān)鍵詞：同型半胱氨酸；THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；動脈粥樣硬化
動脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）是一類以脂代謝異常和炎癥反應(yīng)為主的復(fù)雜性病變，其與脂質(zhì)沉積、炎性細(xì)胞浸潤、局部血栓形成及氧自由基產(chǎn)生增多有關(guān)。本研究以THP-1單核細(xì)胞源性的巨噬細(xì)胞為研究對象，用不同濃度的Hcy干預(yù)后觀察膽固醇流出和ox-LDL的含量，并檢測ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)，為進一步揭示Hcy在動脈粥樣硬化中的作用提供理論基礎(chǔ)。
1 資料與方法
1.1 一般資料 THP-1單核細(xì)胞株由本實驗室保存；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；總膽固醇檢測試劑盒為北京北化康泰臨床試劑有限公司產(chǎn)品；GRP78、CHOP、XBP-1 及ox-LDL檢測試劑盒為Groundwork Biotechnology Diagnosticate 公司產(chǎn)品；Hcy、佛波酯（PMA）為Sigma公司產(chǎn)品，其余試劑為國產(chǎn)分析純[1]。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 取本實驗室液氮中凍存的THP-1單核細(xì)胞株復(fù)蘇后，用含15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。待細(xì)胞融合到80%～90%時，每瓶加入含500nM 佛波酯（PMA）的培養(yǎng)液孵育48h，誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞。實驗分組：①對照組：以不加Hcy巨噬細(xì)胞為空白對照組（0 M Hcy）。②實驗組：在巨噬細(xì)胞中分別以50、100、200、500 M Hcy處理細(xì)胞，③干預(yù)組：100 M Hcy+葉酸+維生素B12（VB12），各組分別培養(yǎng)24 h后檢測后續(xù)指標(biāo)。
1.2.2 TC的測定 采用酶法測定巨噬細(xì)胞TC含量，按照試劑盒說明書操作，分別檢測各組TC水平。
1.2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白的測定 各組細(xì)胞孵育后，收取并裂解細(xì)胞，取細(xì)胞上清液后，按照ELISA試劑盒說明書測定各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白（CHOP、XBP-1、GRP78）的含量。
1.2.4 ox-LDL含量的測定 反復(fù)凍融細(xì)胞，離心后取細(xì)胞上清液用ELISA法測定細(xì)胞內(nèi)ox-LDL 的含量，按照ELISA試劑盒說明書依次測量各孔OD值，記錄并分析數(shù)據(jù)。
1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 結(jié)果以x±s表示，應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩樣本均數(shù)間比較采用Student's t檢驗，多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗，以P
2 結(jié)果
2.1 THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的培養(yǎng) THP-1單核細(xì)胞是懸浮生長的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、大小均一、胞膜完整（圖1A）。經(jīng)PMA誘導(dǎo)48h后在顯微鏡下觀察顯示此時細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)，形狀不規(guī)則并有偽足伸出的巨噬細(xì)胞（圖1B）。
2.2 Hcy對巨噬細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量變化 不同濃度的Hcy干預(yù)人THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞24h后，與對照組相比，各實驗組巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚集顯著增加，尤其是以100 M Hcy組TC升高最明顯，差異有顯著性（P
2.3 Hcy 對巨噬細(xì)胞內(nèi)ox-LDL 的影響 與對照組比較，不同濃度Hcy干預(yù)后THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)ox-LDL的含量均有所增加，以100 MHcy組最明顯，差異有顯著性 （P
3 討論
同型半胱氨酸 （Homocysteine，Hcy）被認(rèn)為是AS的獨立危險因素，其機制與內(nèi)皮細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激、脂代謝紊亂等有關(guān)。不同濃度Hcy干預(yù)THP-1源性巨噬細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，隨著Hcy濃度升高，巨噬細(xì)胞內(nèi)TC含量升高，表明Hcy也可以促使巨噬細(xì)胞發(fā)生泡沫化，推測Hcy抑制了巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇異常增加并導(dǎo)致脂質(zhì)的堆積，從而介導(dǎo)了泡沫細(xì)胞的形成和AS的發(fā)生發(fā)展。
Hcy不僅影響脂代謝，它本身是蛋氨酸循環(huán)過程的中間代謝產(chǎn)物，含有活潑而自由的巰基，容易發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生大量的H2O2和O2-，過量的活性氧使LDL氧化生成ox-LDL。ox-LDL通過增加炎性細(xì)胞因子的表達(dá)、增強細(xì)胞毒性反應(yīng)、抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的產(chǎn)生。本實驗探討了Hcy對巨噬細(xì)胞膽固醇流出的影響及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用機制，進一步補充和完善了Hcy引起動脈粥樣硬化的機制。