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【摘要】目的采用熒光光度法測(cè)定加替沙星的含量。方法在pH6.0的Britton-Robinson(B-R)緩沖溶液中,剛果紅能與鈣黃綠素生成配合物,使鈣黃綠素熒光猝滅,加入加替沙星后,加替沙星與剛果紅可生成比鈣黃綠素-剛果紅更穩(wěn)定的配合物,使鈣黃綠素游離重現(xiàn)熒光。結(jié)果將該方用于片劑、粉針劑和尿液中加替沙星的測(cè)定,結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的紫外法一致。結(jié)論所用方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏。

【關(guān)鍵詞】鈣黃綠素;剛果紅;加替沙星

Fluorometrydeterminationofgatifloxacinwithcalcein-congored

【Abstract】ObjectiveToestablishamethodfordeterminationofgatifloxacinbyfluorometry.MethodsThecomplexbetweencongored(CR)andcalceininpH6.0Britton-Robinson(B-R)buffersolutionquenchedfluorescenceofcalcein.Thecomplexofgatifloxacin-CRwasmorestablethanthatofcalcein-CR.Whengatifloxacinwasaddedintosystem,thecalceincouldbefreedanditsfluorescenceappearedagain.ResultsThismethodhadbeenappliedtothedeterminationofgatifloxacinintablet,injectionandurine,andtheresultswereveryclosetothoseobtainedbyusingUVmethodthatreported.ConclusionThismethodissimple,rapid,accurateandsensitive.

【Keywords】calcein;congored;gatifloxacin

加替沙星(gatifloxacin,AM-1155,GFLX)是新的第四代喹諾酮類抗生素藥物,具有抗菌譜廣,抗菌活性強(qiáng)的特點(diǎn)。它對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌及衣原體均具有強(qiáng)大的抗菌作用[1]。加替沙星的測(cè)定方法有高效液相色譜法、熒光光度法、反相離子對(duì)色譜法、高效毛細(xì)管電泳法和紫外分光光度法[2~6]等。但利用鈣黃綠素-剛果紅熒光體系來(lái)測(cè)定加替沙星含量還未見報(bào)道。本文經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)剛果紅能與鈣黃綠素生成沒有熒光的配合物,使鈣黃綠素?zé)晒忖?加入加替沙星后,加替沙星與剛果紅反應(yīng)生成比鈣黃綠素-剛果紅更穩(wěn)定的配合物,游離出鈣黃綠素,釋放出熒光。以此為基礎(chǔ),建立了測(cè)定加替沙星的新方法。

1實(shí)驗(yàn)與方法

1.1儀器與試劑pHS-3CT型酸度計(jì)(上海大中儀器有限公司);970CRT型熒光分光光度計(jì)(上海精密儀器廠);Labtech-1000紫外-可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)。

加替沙星片(通化金馬藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,批號(hào):20080201,每片0.1g);沙星粉針劑(浙江亞太藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):070201,每安瓿0.2g)。

加替沙星對(duì)照品(GFLX,0.2g/L,河南省藥檢所提供)溶液:準(zhǔn)確稱取0.0200gGFLX,加水溶解后定量轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中,用水定容,用時(shí)逐級(jí)稀釋。鈣黃綠素(1×10-4mol/L):準(zhǔn)確稱取0.0175g鈣黃綠素,加少量水溶解后配制成溶液250ml。剛果紅(CR1×10-4mol/L)準(zhǔn)確稱取0.6967gCR,加少量水溶解后配制成溶液1000ml。B-R緩沖溶液:取濃度均為0.04mol/L的硼酸,磷酸,醋酸混合溶液,用0.20mol/L的NaOH調(diào)至所需pH值。所用試劑均為分析純,水為二次重蒸水。

1.2實(shí)驗(yàn)方法在10ml容量瓶中依次加入1.5mlB-R緩沖溶液(pH6.0)、0.5ml鈣黃綠素溶液、5mlCR溶液和適量GFLX溶液,用水稀釋至刻度,搖勻。在λex/λem=492nm/514nm,470~540nm之間進(jìn)行熒光同步掃描。

2結(jié)果與討論

2.1體系的熒光特性在pH6.0的B-R緩沖溶液中按實(shí)驗(yàn)方法對(duì)鈣黃綠素、鈣黃綠素-CR、鈣黃綠素-CR-GFLX體系進(jìn)行熒光掃描,由圖1可知鈣黃綠素在500nm處有強(qiáng)烈熒光,加入剛果紅后熒光猝滅,再加入加替沙星,熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

2.2酸度的影響試驗(yàn)不同酸度的B-R緩沖溶液對(duì)體系的影響(見圖2)。實(shí)驗(yàn)表明:pH為6.0時(shí),鈣黃綠素和鈣黃綠素-CR的熒光最強(qiáng),并且猝滅程度最大,因此選擇pH6.0的B-R緩沖溶液。

2.3緩沖溶液用量的影響試驗(yàn)B-R緩沖溶液(pH6.0)不同用量時(shí)對(duì)體系的影響(見圖3)。實(shí)驗(yàn)表明:用量為1.5ml時(shí),體系的熒光強(qiáng)度最強(qiáng),且猝滅程度最大,因此選擇pH6.0的B-R緩沖溶液1.5ml。

2.4CR用量的影響試驗(yàn)CR不同用量時(shí)對(duì)體系的影響(見圖4)。實(shí)驗(yàn)表明:隨著CR的逐漸增加,熒光強(qiáng)度逐漸降低,當(dāng)用量大于4.5ml時(shí),體系達(dá)到穩(wěn)定,因此選擇CR溶液5.0ml。

2.5時(shí)間的影響考察了2h內(nèi)時(shí)間對(duì)體系的影響(見圖5)。實(shí)驗(yàn)表明:反應(yīng)在常溫下很快完成,且在2h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.6干擾試驗(yàn)對(duì)藥品輔料和尿液中常見的物質(zhì)以及金屬離子進(jìn)行了試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明:在誤差±5%范圍內(nèi),500倍的葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、尿素、NH+4、Na+和K+不干擾測(cè)定;5倍的Mg2+、Zn2+和Fe3+不干擾測(cè)定。

2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限按實(shí)驗(yàn)方法,在10ml容量瓶中依次加入1.5mlB-R緩沖溶液(pH=6.0)、0.5ml鈣黃綠素溶液、5mlCR溶液和適量GFLX對(duì)照品溶液,用水稀釋至刻度,搖勻,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制工作曲線(見圖6)。實(shí)驗(yàn)表明:加替沙星質(zhì)量濃度在2.0~8.0mg/L范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為:Y=42.066+5.6866C(r=0.9991),檢出限為0.051mg/L。

3樣品的測(cè)定

3.1片劑中GTFX的測(cè)定取加替沙星樣品10片,研磨均勻,精密稱取0.177g(相當(dāng)于加替沙星0.1g)加水溶解后定量轉(zhuǎn)移置1000ml容量瓶中,用蒸餾水定容,干過(guò)濾,棄去初濾液,收集續(xù)濾液得樣品溶液。按實(shí)驗(yàn)方法,用工作曲線法進(jìn)行測(cè)定,用文獻(xiàn)[6]的紫外分光光度法做對(duì)照實(shí)驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見表1。

3.2粉針劑中GTFX的測(cè)定精密稱取0.143g(相當(dāng)于加替沙星0.1g)粉針劑,加水溶解后置1000ml容量瓶中,用蒸餾水定容,干過(guò)濾,棄去初濾液,收集續(xù)濾液得樣品溶液。按實(shí)驗(yàn)方法,用工作曲線法進(jìn)行測(cè)定,用文獻(xiàn)[6]的紫外分光光度法做對(duì)照實(shí)驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見表1。表1片劑和粉針劑中加替沙星的測(cè)定結(jié)果

3.3尿液中GTFX的測(cè)定取10ml加替沙星對(duì)照品溶液于100ml容量瓶中,用尿液定容,制成人工合成尿樣。準(zhǔn)確量取尿樣溶液1ml于10ml容量瓶中,用甲醇定容后在離心機(jī)中離心5min(5500r/min),取上清液用工作曲線法進(jìn)行測(cè)定,用文獻(xiàn)[6]的紫外分光光度法做對(duì)照實(shí)驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見表2。

3.4回收率試驗(yàn)在樣品溶液中加入適量的加替沙星對(duì)照品溶液,按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行回收率試驗(yàn)(見表3)。表2尿液中加替沙星的測(cè)定結(jié)果表3方法回收率試驗(yàn)

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