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【摘要目的摘要:克隆人膀胱逼尿肌中腎上腺素能β3受體基因全長(zhǎng)，并構(gòu)建其反義真核表達(dá)載體.方法摘要:采用RTPCR法從人膀胱逼尿肌中擴(kuò)增出β3AR的全長(zhǎng)cDNA序列，上游引物5′端加有BamHI及ClaI酶切位點(diǎn)，下游引物加有HindIII酶切位點(diǎn)，將該片段插入pUC18載體中，搖菌擴(kuò)增后，用ClaI和HindIII切下目的基因，然后將目的片段反向插入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLNCX上.最后對(duì)產(chǎn)生的重組子進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序鑒定.結(jié)果摘要：經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定，所克隆的目的基因大約為1.2kb，并成功地連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX上，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，插入的目的片段其堿基序列和Genbank上報(bào)道的完全一致，且插入載體的方向完全正確.結(jié)論摘要：成功克隆了人逼尿肌中腎上腺素能β3受體基因的全長(zhǎng)cDNA序列和構(gòu)建了其反義真核表達(dá)載體.

【受體;腎上腺素能β3;載體

0引言

膀胱逼尿肌活動(dòng)亢進(jìn)是下尿路癥狀的常見原因.探究發(fā)現(xiàn)，腎上腺素能β受體（βadrenoceptor,βAR）亞型能夠介導(dǎo)膀胱平滑肌松弛，對(duì)維持儲(chǔ)尿過程中膀胱良好的順應(yīng)性起著關(guān)鍵功能［1］.但何種βAR亞型介導(dǎo)逼尿肌松弛，國(guó)內(nèi)外學(xué)者還有一定的爭(zhēng)論［2-3］.為進(jìn)一步探索βAR亞型在逼尿肌中功能奠定基礎(chǔ)，我們擬采用反義基因（antisense）技術(shù)，構(gòu)建βAR亞型的反義真核表達(dá)載體，封閉三種βAR中的任意兩個(gè)，得到表達(dá)單一亞型的細(xì)胞克隆，再進(jìn)一步進(jìn)行探究，以確定βAR激活對(duì)逼尿肌細(xì)胞的松弛和增殖的影響，并為尋找新的最終解決膀胱逼尿肌活動(dòng)亢進(jìn)的治療方法提供理論依據(jù).

1材料和方法

1.1材料人膀胱逼尿肌標(biāo)本取自手術(shù)中因膀胱癌而行膀胱全切患者標(biāo)本，取正常組織的膀胱平滑肌約1g，迅速放入液氮中10min，再放入-70℃冰箱中保存.pUC19購于Takara公司；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體plncx購自Invitrogen公司；JM109大腸桿菌感受態(tài)菌株購自Takara公司.限制性內(nèi)切酶和DNA工具酶BamHI，HindIII，ClaI等內(nèi)切酶購于華美生物有限公司；RNase和T4DNA連接酶購于Promega公司.Trizol試劑及RNALAPCRTMKit(AMV)購自大連寶生物公司；QiAquickGelExtractionKit購于Qiagen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Gibco公司.

1.2方法

1.2.1人膀胱逼尿肌中β2AR全長(zhǎng)基因的克隆稱取冰凍狀態(tài)下的膀胱逼尿肌組織約200mg，采用寶生物公司的Trizol試劑并按使用說明書操作提取總RNA，10g/L低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠鑒定RNA的含量及完整性.根據(jù)Genebank提供的β3AR基因序列（NM_000024）采用Oligo6.6軟件設(shè)計(jì)如下兩對(duì)引物，外引物及內(nèi)引物，應(yīng)用套式PCR來擴(kuò)增目的基因.

內(nèi)引物摘要：上游引物F01摘要：5′CCGGATCCATCGATATGGGGCAACCCGGGAACGG3′,下游引物R01摘要：5′AGGAAGCTTTTACAGCAGTGAGTCATTTG3′;外引物摘要：上游引物F02摘要：5′TGCGCTTACCTGCCAGACTG3′,下游引物R02摘要：5′GCCCTTCCTTCTGCATATCTC3′.

其中內(nèi)引物是針對(duì)蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS摘要:220~1461bp）設(shè)計(jì)的，其上游加有BamHI及ClaI酶切位點(diǎn)，下游加有HindIII位點(diǎn)，使其能反向連接在pLNCX的多克隆位點(diǎn)上.外引物F02，R02可擴(kuò)增βARcDNA第194~1587bp.引物由大連寶生物公司合成.取總RNA1μL采用寶生物公司的RNALAPCRTMKit(AMV)試劑盒進(jìn)行RTPCR反應(yīng).取8μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠跑電泳，并用BIORADFlus凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析.

1.2.2β2AR基因反義真核表達(dá)載體的構(gòu)建PCR產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠跑電泳除雜質(zhì)，并用柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收.回收產(chǎn)物和pUC18克隆載體分別用BamHI和HindIII酶切后在T4DNA連接酶的功能下16℃過夜連接.取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，涂布含有氨芐青霉素、IPIG和Xgal的平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取白色菌落并作標(biāo)記，通過菌落PCR鑒定陽性重組克隆.將含有陽性重組質(zhì)粒的菌落挑入適量LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)過夜，采用Gibco公司的質(zhì)粒提取試劑盒制備質(zhì)粒，一部分作BamHI+HindIII雙酶切鑒定正確后將其命名為pUCβ3AR；一部分用ClaI+HindIII雙酶切后，10g/L瓊脂糖凝膠回收1.2kb目的基因；隨后用ClaI+HindIII雙酶切逆轉(zhuǎn)錄病毒載體plncx，并用Qiagen公司的QiAquickGelExtractionKit后回收plncx經(jīng)酶切后所產(chǎn)生的載體片段，經(jīng)T4DNA連接酶連接目的基因及載體片段（16℃水浴過夜連接），搖菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后，用ClaI+HindIII雙酶切進(jìn)行電泳鑒定.插入片段的堿基序列及其插入方向采用DNA測(cè)序方法進(jìn)行鑒定（由大連寶生物公司鑒定）.鑒定正確后將β3AR反義真核表達(dá)載體命名為pLNCXβ3AR（圖1）.

2結(jié)果

2.1目的基因克隆反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PCR擴(kuò)增，10g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示RTPCR結(jié)果和預(yù)期長(zhǎng)度一致（1.2kb，圖1）.

2.2pLNCXβ3AR反義表達(dá)載體的酶切鑒定其結(jié)果和理論設(shè)計(jì)完全相符（圖2）.

1摘要:dl2000marker;2摘要：β3AR;3摘要:陰性對(duì)照.

圖1β3AR目的基因產(chǎn)物的RTPCR檢測(cè)（略）

1摘要:dl2000marker;2摘要:pLNCXβ3AR;3摘要:空白對(duì)照;4摘要:λHindIIImarker.

圖2pLNCXβ3AR反義表達(dá)載體的酶切鑒定（略）

2.3pLNCXβ3AR載體中目的基因的堿基序列及其插入方向測(cè)序結(jié)果顯示我們所克隆進(jìn)入plncx的目的片段其堿基序列和Genebank所提供的β3AR的堿基序列完全一致，且插入方向完全正確，表明我們已經(jīng)成功構(gòu)建了人膀胱逼尿肌腎上腺素能β3受體基因的反義真核表達(dá)載體摘要：

TGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAG

TTCTGTATGAGACCACTCGGATCCCGCAACAACTCT

GTTGATCATTCAAGAGATGATCAACAGAGTTGTTGCT（測(cè)序）.

3討論

反義技術(shù)是目前許多領(lǐng)域應(yīng)用得比較多的一種基因治療技術(shù)，其概念就是應(yīng)用反義核酸在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷某些基因的表達(dá)［4］.反義技術(shù)一般分三種方法摘要：第一種是應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體將反義的寡鏈核苷酸帶入細(xì)胞內(nèi)部，和mRNA結(jié)合，將其屏蔽掉.第二種是將反義基因（cDNA）連接到所需的表達(dá)載體（質(zhì)粒，病毒）上，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄出反義RNA，并和靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)錄過程，從而最終阻止蛋白的表達(dá).第三種是核酶，它是一種具有酶切割活性的反義核酸，和相應(yīng)的mRNA結(jié)合后能發(fā)揮酶活性將其降解.我們的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了第二種方法，即應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體重組β3AR反義RNA，成功地構(gòu)建了β3AR反義RNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，以期在基因水平上封閉β3AR的表達(dá)，來探索β3AR亞型在膀胱逼尿肌松弛過程中的可能價(jià)值.在我們的實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)楦鶕?jù)相關(guān)文獻(xiàn)［5］，β3AR無內(nèi)含子成分，無法針對(duì)其中的外顯子來構(gòu)建載體，故此我們選擇了以全長(zhǎng)的β3ARcDNA序列為模板構(gòu)建載體，來完成封閉功能.

目的基因的獲得我們是通過RTPCR的方法.在實(shí)驗(yàn)的最初我們只是基于β3AR的蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS）設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，并根據(jù)plncx和pUC19的多克隆位點(diǎn)在上下游設(shè)計(jì)了三個(gè)酶切位點(diǎn)，使其能通過克隆擴(kuò)增后反向連接到真核表達(dá)載體中，應(yīng)用此對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，電泳結(jié)果在1.4kb處有微弱亮帶(目的基因?yàn)?.2kb)，且四周有很多雜帶存在，將1.4kb泳帶切膠回收后，經(jīng)測(cè)序證實(shí)不是我們想要的目的基因，分析可能是引物的特異性不高，在β3ARmRNA的其他的位置亦有此引物的結(jié)合位點(diǎn)所造成的，故此又以5′上游及3′下游非翻譯區(qū)為模板設(shè)計(jì)了一對(duì)外引物，先用外引物擴(kuò)增后，再用帶有內(nèi)切酶的內(nèi)引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果得到了1.2kb的單一片段，保證了反應(yīng)的特異性.

腎上腺素能β受體分為三種亞型，β1，β2和β3.目前對(duì)于腎上腺素能β受體的探究，大多是應(yīng)用βAR亞型選擇性的受體激動(dòng)劑來探究其在膀胱松弛過程中的功能［6-8］，但其選擇性依靠于受體激動(dòng)劑的特異性，而我們構(gòu)建βAR亞型的反義真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)錄出反義的βAR，從基因水平封閉其亞型的表達(dá)，然后用非選擇性βAR激動(dòng)劑處理細(xì)胞以消除激動(dòng)劑親和性和效能差異造成的影響，則更加確切.我們選用的真核表達(dá)載體pLNCX是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，相對(duì)于脂質(zhì)體而言，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率極高，最高時(shí)可達(dá)100%，并且可以將目的基因整合到宿主細(xì)胞的染色體中長(zhǎng)期表達(dá)，可以使我們能有足夠的時(shí)間來觀察在β3AR其他兩種亞型被抑制之后的膀胱平滑肌的各種生物學(xué)特性的改變.而后者往往由于細(xì)胞攝入率較低或進(jìn)入細(xì)胞后即被降解而影響其反義抑制效果［9］.經(jīng)酶切鑒定和序列分析，本實(shí)驗(yàn)所克隆的βAR全長(zhǎng)cDNA序列和Genbank上報(bào)道的完全一致且插入載體的方向也完全正確，重組病毒載體plncxβAR經(jīng)雙酶切鑒定，釋放出1.2kb的片段，說明βAR逆轉(zhuǎn)錄病毒反義真核表達(dá)載體已構(gòu)建成功，這就為下一步βAR亞型功能的探究奠定了基礎(chǔ).

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