導(dǎo)語：透視肌源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子修復(fù)論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要目的摘要：觀察肌源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（MDNF）對(duì)大鼠四周神經(jīng)損傷修復(fù)的影響.方法摘要：從成鼠骨骼肌中提取出MDNF，取10μLMDNF（0.1mg/L）注射到大鼠坐骨神經(jīng)損傷段為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（注射生理鹽水）和正常對(duì)照組.術(shù)后20d用辣根過氧化物酶示蹤法（HRP）、尼氏染色法、非凡三色染色法對(duì)再生神經(jīng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì).結(jié)果摘要：注射MDNF的四周神經(jīng)損傷部有再生的神經(jīng)纖維通過；MDNF組的再生神經(jīng)在形態(tài)學(xué)及計(jì)量學(xué)上均優(yōu)于生理鹽水組.結(jié)論摘要:肌源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)四周神經(jīng)損傷后的修復(fù)有較好的促進(jìn)功能.

【神經(jīng)生物學(xué)；肌源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；四周神經(jīng)損傷；四周神經(jīng)再生；辣根過氧化物酶；大鼠

0引言

四周神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的再生能力.但是，無論怎樣精確的神經(jīng)修復(fù)，其功能都很難再恢復(fù)到損傷前的水平［1］.通過提高外科手術(shù)技術(shù)、電或磁的刺激［2］、組織的摘除以及雪旺氏細(xì)胞的巧妙處理等方法來促進(jìn)四周神經(jīng)損傷后的修復(fù)工作已做了很多.最近，對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分子通路以及生理功能的理解有了重大的進(jìn)展.這些因子包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3，4，5，6以及膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等等，它們影響著不同的神經(jīng)細(xì)胞亞群，在中樞和四周神經(jīng)系統(tǒng)中均有著復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)功能.許多探究表明，骨骼肌組織中也存在著對(duì)神經(jīng)元有營(yíng)養(yǎng)功能的物質(zhì).Oppenheim等將從大鼠的這種物質(zhì)中分離出的Mr為10000~30000組份蛋白命名為“肌源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子”（musclederivedneurotrophicfactor，MDNF），它能促進(jìn)胚胎脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)，并對(duì)其損傷具有保護(hù)功能［3］.我們通過辣根過氧化物酶示蹤法、尼氏染色法、非凡三色染色法觀察MDNF對(duì)坐骨神經(jīng)損傷后修復(fù)的影響.

1材料和方法

1.1材料

Wistar大鼠（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供）;Tyrode溶液，低溫高速離心機(jī)（上海華亭TGL16G）;中空纖維超濾器（UltrafiltrationwiththePorousFibertubers，北京宣武超濾設(shè)備廠）;電腦自動(dòng)記錄儀記錄（上海滬西儀器廠）;電泳儀（北京六一電泳儀器廠）;HRP（中山公司）.

1.2方法

1.2.1成鼠MDNF的制備用80只成年Wistar大鼠，切取四肢，在手術(shù)顯微鏡下剝離骨骼肌組織塊.骨骼肌組織用Tyrode溶液浸泡（1∶5）后，再經(jīng)超聲粉碎、低溫高速離心30min得上清液.經(jīng)中空纖維超濾器截取Mr為10000~50000的蛋白液，然后在層析柜內(nèi)過交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）G75（Pharmacia產(chǎn)品）層析柱，柱長(zhǎng)1m，用PBS平衡液洗脫，流速為0.3mL/min，自動(dòng)收集器收集，紫外檢測(cè)，波長(zhǎng)280nm，電腦自動(dòng)記錄儀記錄.層析預(yù)截取的Mr10000~30000洗脫液經(jīng)冷凍干燥后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺梯度凝膠，中范圍分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白做對(duì)照（Pharmacia）.電壓150V，0.5~1h，硝酸銀染色.

1.2.2動(dòng)物分組及手術(shù)方法雄性健康Wister大鼠18只，體質(zhì)量250g左右，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和正常對(duì)照組,每組6只.用異戊巴比妥鈉麻醉劑腹腔注射麻醉（2.5mL/kg），于大鼠右側(cè)股后部正中切口，在手術(shù)顯微鏡下解剖坐骨神經(jīng)，自梨狀肌下緣夾傷坐骨神經(jīng)30s，直至夾傷段僅有透明的神經(jīng)外膜.實(shí)驗(yàn)組用100mg/L的MDNF10μL注入夾傷處，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組注射生理鹽水10μL.正常對(duì)照組未經(jīng)任何注射，術(shù)后各組大鼠按常規(guī)飼養(yǎng)20d.

1.2.3檢測(cè)方法①HRP示蹤試驗(yàn)摘要：各組隨機(jī)抽取大鼠2只，于夾傷處遠(yuǎn)端4mm處的坐骨神經(jīng)干注入150g/L的HRP溶液10μL，縫合好傷口，繼續(xù)飼養(yǎng)72h，多聚甲醛灌注后取腰段脊髓固定，振動(dòng)切片，進(jìn)行四甲基聯(lián)苯胺法染色，觀察各組HRP標(biāo)記的情況.②Nissl染色摘要：各組大鼠剩余的4只用多聚甲醛灌注，取脊髓腰段，石蠟包埋，切片，展片后進(jìn)行尼氏染色，觀察神經(jīng)元胞體數(shù).③非凡三色染色摘要：各組大鼠剩余的4只用多聚甲醛灌注后，取坐骨神經(jīng)夾傷段、坐骨神經(jīng)夾傷遠(yuǎn)端、近端，石蠟包埋連續(xù)切片，夾傷段縱切，遠(yuǎn)、近端既縱切，又橫切，觀察神經(jīng)再生、髓鞘形成情況，計(jì)量學(xué)分析遠(yuǎn)、近端的軸索數(shù)，遠(yuǎn)端的軸索直徑和髓鞘厚度.

2結(jié)果

2.1HRP示蹤試驗(yàn)MDNF組HRP標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)和其余二組均有顯著性差異（P%26lt;0.01，表1）.

2.2Nissl染色Nissl染色后，實(shí)驗(yàn)組脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組有差異（P%26lt;0.05），兩組和正常對(duì)照組均有顯著性差異（P%26lt;0.01，表1）.表1HRP標(biāo)記和Nissl染色脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)據(jù)(略)

2.3非凡三色染色實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組坐骨神經(jīng)夾傷20d時(shí)，兩組坐骨神經(jīng)夾傷段的遠(yuǎn)端、近端都不同程度地發(fā)生了Waller變性.實(shí)驗(yàn)組（圖1，2）和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（圖3）近端的神經(jīng)纖維損傷分別比遠(yuǎn)端輕.在近端橫切面中還能看到大量的正常的有髓神經(jīng)纖維，軸索被染為綠色點(diǎn)狀，軸索四面的髓鞘被染成紅色（圖1）；縱切面中能見到大量的正常有髓神經(jīng)纖維，染成紅色的為髓鞘，在紅色髓鞘的中間有一條綠色的細(xì)線為軸索，縱切面中也能見到正在變性和已變性的沒被染成紅色的神經(jīng)纖維（圖2，3）.在變性的神經(jīng)纖維神經(jīng)膜管的內(nèi)面還能見到少量的Schwann細(xì)胞（圖2）.實(shí)驗(yàn)組（圖1）、正常對(duì)照組（圖4）、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組近端軸索數(shù)沒有差異（表2）.表2有髓神經(jīng)纖維組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)果（略）

實(shí)驗(yàn)組（圖5，6）和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（圖7，8）遠(yuǎn)端的神經(jīng)纖維損傷很重.在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組橫切面上（圖7）能見到大量的變性神經(jīng)纖維，綠色點(diǎn)狀軸索和紅色髓鞘少見；在實(shí)驗(yàn)組（圖5）也能見到變性神經(jīng)纖維，但綠色軸索和紅色髓鞘較多.在縱切面上，實(shí)驗(yàn)組（圖6）神經(jīng)纖維因損傷髓鞘腔崩解，髓鞘斷裂成為分節(jié)狀結(jié)構(gòu)，在神經(jīng)膜區(qū)域內(nèi)仍可見大量塊狀髓鞘碎片，神經(jīng)膜管有的萎縮、變窄，大量的Schwann細(xì)胞在神經(jīng)膜管的內(nèi)面形成Büngner帶；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（圖8）神經(jīng)纖維髓鞘碎片已不成塊狀，呈松馳狀，大部分都已消失，神經(jīng)膜管都已萎縮、變窄，大量的Schwann細(xì)胞在神經(jīng)膜管的內(nèi)面形成Büngner帶.實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組遠(yuǎn)端軸索數(shù)、軸索直徑和髓鞘厚度有差異（P%26lt;0.05），兩組均和正常對(duì)照組有顯著性差異（P%26lt;0.01）.實(shí)驗(yàn)組損傷段（圖9，10）縱切面上能見到許多髓鞘腔和Schwann細(xì)胞，一些髓鞘腔內(nèi)有少量的紅色的髓鞘（圖10）；對(duì)照實(shí)驗(yàn)組損傷段（圖11，12）縱切面上幾乎見不到髓鞘腔和髓鞘，大多是疤痕、結(jié)締組織和變性的神經(jīng)纖維.

3討論

神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展和維持依靠著神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子.最初，人們只注重神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷后的修復(fù)功能，而很少留意它們對(duì)四周神經(jīng)再生的影響.圖1實(shí)驗(yàn)組近端坐骨神經(jīng)(綠色點(diǎn)狀為軸索

近10余年來，出現(xiàn)了一大批有關(guān)MDNF的探究證實(shí)MDNF對(duì)神經(jīng)元具有促進(jìn)生長(zhǎng)、減少死亡等功能.現(xiàn)已證實(shí)，大鼠MDNF對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有很好的抑制功能，它不但能夠拯救胎齡6~9d凋亡期的1/4運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元不死亡，而且?guī)缀蹩墒剐律笄袛嗪蟮倪\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元全部存活.大鼠MDNF是否也象其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子一樣對(duì)四周神經(jīng)損傷后的修復(fù)有促進(jìn)功能呢？本實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)損傷后，經(jīng)MDNF孵育的實(shí)驗(yàn)組遠(yuǎn)端在軸索數(shù)、軸索直徑和髓鞘厚度均高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組.在四周神經(jīng)中，髓鞘厚度、軸索直徑、軸索數(shù)被用來評(píng)價(jià)神經(jīng)再生［4］.結(jié)果說明，MDNF對(duì)四周神經(jīng)損傷后的再生有促進(jìn)功能.探究還發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組HRP標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)以及Nissl染色的神經(jīng)元數(shù)均比實(shí)驗(yàn)對(duì)照組高；非凡三色染色中，實(shí)驗(yàn)組坐骨神經(jīng)損傷段遠(yuǎn)端縱切面上仍有大量的塊狀髓鞘碎片，而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中髓鞘碎片大部分消失，且實(shí)驗(yàn)組坐骨神經(jīng)損傷段有新生的髓鞘生成.結(jié)果說明，MDNF對(duì)四周神經(jīng)損傷的修復(fù)有促進(jìn)功能.但另一方面，實(shí)驗(yàn)組的髓鞘厚度、軸索直徑、軸索數(shù)、HRP標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)、Nissl染色的神經(jīng)元數(shù)均低于正常對(duì)照組，MDNF對(duì)四周神經(jīng)損傷的修復(fù)也是不完全的.肌源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)四周神經(jīng)再生有促進(jìn)功能，至于MDNF是如何促進(jìn)四周神經(jīng)再生以及其促進(jìn)再生的發(fā)生率均有待于進(jìn)一步探究.

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