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【關(guān)鍵詞】 生物相容性；異種去細(xì)胞肌腱；制備；實(shí)驗

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.28.195

對于大面積深度燒傷的患者來說， 其自體皮源十分匱乏， 目前臨床上較為有效的一類治療方案為自體微粒皮移植手術(shù)[1]。其中選擇性去細(xì)胞異種皮可幫助患者誘導(dǎo)細(xì)胞生長分化， 并有效保護(hù)創(chuàng)面， 將該項技術(shù)用于修復(fù)深度燒傷創(chuàng)面患者的臨床意義顯著。本次研究采取動物實(shí)驗方案， 并取得了十分顯著的應(yīng)用效果， 具體報告如下。

1 材料與方法

1. 1 動物與主要試劑 選取3只健康白色家豬， 平均體重（76±8）kg， 成年Wistar大鼠70只， 平均體重（252±14）g， 成年SD大鼠5只， 平均體重（258±12）g， 主要試劑包括25%的戊二醛、胰蛋白酶、小鼠成纖維細(xì)胞等。

1. 2 實(shí)驗方法

1. 2. 1 將家豬處死后去毛， 并將大張全厚皮剝離后去除脂肪， 將戊二醛稀釋至0.1%， 對表皮面連續(xù)固定60 min， 反復(fù)沖洗后削為0.4～0.8 mm厚的斷層皮片， 并采用新潔爾滅連續(xù)浸泡15 min， 采用生理鹽水反復(fù)進(jìn)行清洗， 給予0.25%的胰蛋白酶消化30 min（37℃）， 并置入TritonX-100溶液內(nèi)持續(xù)進(jìn)行震蕩24 h， 將其反復(fù)進(jìn)行沖洗后置入冰箱內(nèi)（4℃）保存， 并將包含慶大霉素的生理鹽水連續(xù)浸泡24 h， 并且每隔6 h換取1次液體， 將其進(jìn)行封裝、輻照消毒并保存。對表皮的保留情況、皮片顏色、質(zhì)地等進(jìn)行嚴(yán)密觀察， 將選擇性去細(xì)胞異種皮置于甲醛溶液內(nèi)（4%）進(jìn)行固定， 并用石蠟進(jìn)行包埋、切片、HE染色處理等， 對表皮結(jié)構(gòu)、纖維變化情況等進(jìn)行嚴(yán)密觀察， 同時將新鮮的豬皮進(jìn)行對照觀察。

1. 2. 2 5只成年SD大老鼠， 在手術(shù)前24 h對背部進(jìn)行備皮處理， 將氯胺酮與速眠新進(jìn)行混合后對腹腔進(jìn)行注射麻醉處理， 并在大鼠的背部切取全層皮膚， 將其置于生理鹽水內(nèi)備用。70只成年Wistar大鼠， 依據(jù)背部皮下植入材料的不同分為1組、2組、3組， 其中1組選擇性去細(xì)胞異種皮， 2組植入新鮮的豬皮， 3組植入大鼠的異體皮， 并在術(shù)前的24 h選擇背部備皮， 將全層的皮膚切開， 將皮下組織進(jìn)行分離后制備皮下囊， 并植入皮片內(nèi)對切口進(jìn)行縫合處理， 手術(shù)完成后的1、2、4、8、12、16周將大鼠的皮膚切開進(jìn)行觀察， 觀察大鼠的皮片與周圍組織的粘連情況， 并進(jìn)行HE染色處理， 對移植區(qū)域的炎性反應(yīng)程度與新生血管、纖維基質(zhì)細(xì)胞長入情況進(jìn)行觀察分析。

對其進(jìn)行炎性反應(yīng)分級， 分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級。其中Ⅰ級表示試樣的周圍無淋巴細(xì)胞或者極少量的淋巴細(xì)胞；Ⅱ級表示表示出現(xiàn)少量的淋巴細(xì)胞；Ⅲ級表示出現(xiàn)少量的中性粒細(xì)胞、巨細(xì)胞反應(yīng)、淋巴細(xì)胞浸潤等；Ⅳ級表示試樣周圍伴有以中性粒細(xì)胞浸潤為主的炎性反應(yīng)。

2 結(jié)果

2. 1 對選擇性去細(xì)胞異種皮與組織學(xué)進(jìn)行觀察后得知， 大體觀察表現(xiàn)為表皮層較為連續(xù)完整， 其表皮面與真皮面分別為黃白色與瓷白色， 較為柔軟。

2. 2 進(jìn)行皮下植入實(shí)驗后得知， 對其進(jìn)行大體觀察后顯示實(shí)驗動物手術(shù)順利完成， 術(shù)后活動良好， 手術(shù)切口無腫脹、滲液滲出等情況。

3 討論

進(jìn)行微粒皮移植時， 需要采取暫時性的覆蓋物進(jìn)行保護(hù)， 較為常見的覆蓋物包括新鮮豬皮與異體皮， 其中異體皮可以使得大面積燒傷的治愈率得到明顯的提高， 臨床應(yīng)用價值顯著， 但是關(guān)于異體皮的來源受限較多， 且對于傳播病變的微生物可能性難以進(jìn)行徹底的消除， 所以說， 其臨床應(yīng)用受限[2]。而新鮮的豬皮具有價格經(jīng)濟(jì)、來源廣泛等特點(diǎn)， 但是發(fā)生移植后將出現(xiàn)較早時間的排斥反應(yīng)， 并且當(dāng)創(chuàng)面愈合后優(yōu)于真皮取法將使得功能于外觀均不佳。因此， 針對上述問題， 本次研究提出選擇性去細(xì)胞異種皮的概念， 并將其與自體微粒皮進(jìn)行有效結(jié)合， 將其覆蓋深度的燒傷創(chuàng)面將得到較為顯著的應(yīng)用效果。

本次研究選擇戊二醛-胰蛋白酶-去污劑進(jìn)行進(jìn)行選擇性去細(xì)胞異種皮實(shí)驗， 相比以往的臨床研究得知， 其中戊二醛的濃度有所下降， 同時胰蛋白酶的作用時間縮短， 將戊二醛作用于表皮面可以助于滲入表皮層， 并產(chǎn)生氨基酸殘基反應(yīng)， 使得膠原分子能夠與氨基酸側(cè)鏈產(chǎn)生交聯(lián)作用， 將抗原部位進(jìn)行有效遮蔽， 使得膠原分子之間的穩(wěn)定性與張力有所提高。其中胰蛋白酶抗原溶解部分真皮層的基質(zhì)， 使得細(xì)胞間隙較為疏松， 并幫助破壞細(xì)胞的完整性， 使得胰蛋白酶作用時間縮短， 利于將表皮結(jié)構(gòu)完整進(jìn)行保留。而非離子型表面活性劑可以與細(xì)胞膜磷脂進(jìn)行結(jié)合， 并達(dá)到去污、脫細(xì)胞的效果[3， 4]。

本次研究結(jié)果顯示， 對選擇性去細(xì)胞異種皮大體觀察表現(xiàn)為表皮層較為連續(xù)完整， 其表皮面與真皮面分別為黃白色與瓷白色， 較為柔軟；進(jìn)行皮下植入實(shí)驗后得知， 實(shí)驗動物手術(shù)順利完成， 術(shù)后活動良好， 手術(shù)切口無腫脹、滲液滲出等情況。

綜上所述， 采取戊二醛-胰蛋白酶-去污劑制備選擇性去細(xì)胞異種皮具有良好的生物相容性與形態(tài)學(xué)優(yōu)勢。

參考文獻(xiàn)

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關(guān)鍵詞：組織工程 載體支架材料 天然材料 合成材料 復(fù)合材料

中圖分類號：TQ31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-3973（2013）005-052-02

組織工程支架材料在宏觀形態(tài)、微觀結(jié)構(gòu)、機(jī)械強(qiáng)度和韌性、可塑性、毒性、免疫原性和細(xì)胞相容性等方面都有嚴(yán)格的要求。因此，理想的載體支架材料應(yīng)具有如下特征：（1）可塑性較好，能構(gòu)建成特定三維結(jié)構(gòu)。（2）具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和韌性，滿足加工需要。（3）無毒性、無免疫原性、生物相容性好，適宜細(xì)胞正常生理功能的發(fā)揮。（4）能被生物體降解吸收。

目前，組織工程常用載體支架材料包括：天然材料、合成材料和復(fù)合材料。

1 組織工程天然材料

常用于構(gòu)建組織工程載體支架材料的天然材料主要有：殼聚糖、絲素蛋白和纖維蛋白等。殼聚糖與氨基葡聚糖的性能存在一定的相似之處，而后者是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。殼聚糖的這一特性使得其被廣泛的應(yīng)用于組織工程的支架材料的制備過程中。殼聚糖制備的載體支架材料除具有良好的生物相容性，還具有抑菌性和促進(jìn)愈合的性能。將殼聚糖制備的組織工程角膜基質(zhì)進(jìn)行板層移植，兩周后植片脫落，機(jī)械強(qiáng)度不足。閆濤等將絲素蛋白溶液通過透析濃縮后，制成絲素薄膜。但干燥狀態(tài)下的絲素薄膜質(zhì)地脆，容易開裂。新西蘭大白兔角膜埋植實(shí)驗表明，絲素蛋白可以體內(nèi)降解，無明顯毒性，生物相容性較好。

2 組織工程合成材料

應(yīng)用較多的合成組織工程材料主要有聚乳酸（PLA）、聚羥基乙酸（PGA）以及兩者的共聚物（PLGA）等。PGA性質(zhì)穩(wěn)定，以其制備的支架機(jī)械強(qiáng)度、韌性和降解速率均可控。Hong等用PLGA制備組織工程載體支架，進(jìn)行兔脂肪干細(xì)胞接種，體外培養(yǎng)一周后再自體移植。移植后脂肪干細(xì)胞可在支架表面和材料內(nèi)部正常生長、增殖，脂肪干細(xì)胞新分泌合成的膠原纖維和正常角膜膠原纖維較相似，切移植眼角膜內(nèi)皮與上皮仍舊保持完整且能正常行使功能，逐漸透明。胡曉潔等以PGA為原材料制備載體支架，在體外重建角膜基質(zhì)。囊袋法植入兔角膜，8周后材料即可完全降解，移植眼的外觀與對照眼相似，但PGA降解產(chǎn)物會使移植部位pH值降低。

3 組織工程復(fù)合材料

組織工程復(fù)合載體支架材料種類主要有：天然材料之間復(fù)合、天然材料與合成材料之間復(fù)合，以及有機(jī)材料與無機(jī)材料之間復(fù)合。Graf等在復(fù)合材料接種角膜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，證明了其能促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞進(jìn)行正常的生長和增殖，同時誘導(dǎo)角膜感覺神經(jīng)活化，生成YIGSR多肽。有研究顯示，將膠原與TERP復(fù)合材料移植到角膜上6周后，顯示復(fù)合支架材料的生物相容性較好，在基質(zhì)與上皮面之間形成了新的基底膜；復(fù)合材料中與基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞結(jié)合良好，且有神經(jīng)長入；復(fù)合材料中的細(xì)胞能正常行使其生物學(xué)功能。

綜上所述，天然組織工程載體支架材料的優(yōu)點(diǎn)在于具有良好的細(xì)胞生物相容性和安全性，但材料本身存在的機(jī)械強(qiáng)度和韌性不足、降解速率過快等缺陷也是無法忽視的。人工合成組織工程材料本身的物化性能、機(jī)械性能和降解速率都是可控的，可以根據(jù)組織工程構(gòu)建的不同需要進(jìn)行調(diào)節(jié)，利于規(guī)模生產(chǎn)。缺點(diǎn)在于材料本身生物相容性差，且降解產(chǎn)物可能會對生物體產(chǎn)生一定的毒害作用。利用不同性質(zhì)的載體支架材料構(gòu)建的組織工程復(fù)合材料，具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度和韌性，也具有良好的生物相容性和合適的生物降解速率。既彌補(bǔ)了單一天然載體支架材料本身存在的機(jī)械強(qiáng)度和韌性不足、降解速率過快等缺陷，也使得人工合成材料產(chǎn)生細(xì)胞毒性、生物相容性差、缺少細(xì)胞識別位點(diǎn)的局面有了很大改觀。因此，復(fù)合載體支架材料在組織工程化組織或器官的構(gòu)建中越來越受到人們的重視。

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[關(guān)鍵詞]納米羥磷灰石-脂肪族聚酯酰胺；成骨細(xì)胞；生物相容性

[中圖分類號]R 783.1[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.01.009

Biological effects of nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite on the osteoblastsDeng Xia1, Xia Xi2.（1. Dept. of Stomatology, Nuclear of Industry 416 Hospital, Chengdu 610051, China; 2. Dept. of Prosthodontics, The Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015, China）

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the biological effects of nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite（nHA-PEA）on the osteoblast.MethodsThe Dulbecco minimum essential medium（DMEM）leaching liquor of nHA-PEA was applied to the osteoblasts of the test groups while the DMEM itself was applied to control. The methyl thiazolyl tetrazolium assay, flow cytometry and alkaline phosphatase（AKP）analysis were used to evaluate the changes in cell growth, cell cycle and cell function. Moreover, osteoblasts were cultured on the surface of nHA-PEA composite and the attachment, growth and proliferation of osteoblast were investigated. Results The cultured osteoblasts grew well and showed nomorphological variation. Osteoblasts of different test groups demonstrated relative proliferation rate ranging from 92%～107% without dose-dependent effect（P>0.05）. The cell cycle and AKP activity were similar in test and control groups（P>0.05）. Good cell attachment and proliferation manner were observed on the membranes. ConclusionnHA-PEA has no negative effects on the osteoblast and its osteoblastcompatibility is proved.

[Key words]nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite；osteoblast；biocompatibility

有機(jī)-無機(jī)復(fù)合生物材料是組織工程學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]，該材料主要用于修復(fù)和重建人體的硬組織。納米羥磷灰石-脂肪族聚酯酰胺（nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester -amide composite，nHA-PEA）復(fù)合材料由nHA粒子與PEA均勻混合制得，其中羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）是人體骨、牙等無機(jī)組織的主要成分，PEA及其共聚物是一類新型的生物可降解高分子材料[2]。nHA- PEA復(fù)合材料兼具了有機(jī)物的韌性和無機(jī)物的剛性，具有良好的理化性能。本研究將nHA-PEA復(fù)合材料作用于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，檢測其對細(xì)胞生長、增殖能力、細(xì)胞周期、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性的影響，觀察細(xì)胞在其表面的黏附、鋪展形態(tài)，評價其對骨細(xì)胞的相容性和生物活性。

1材料和方法

1.1主要材料和儀器

達(dá)爾貝科極限必需培養(yǎng)液（Dulbecco minimum

essential medium，DMEM）、胰蛋白酶（Gibco公司，美國），新生小牛血清（成都哈里生物工程有限公司），甲噻唑四唑氮（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑（Sigma公司，美國），AKP試劑盒（北京柏定生物工程有限公司）。Sanyomco-17AI二氧化碳孵箱（Sanyo公司，日本），Olympus IX50相差倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），JSM-5900LV型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM；JEOL公司，日本），可見光高效分析儀/HTS 7000plus多孔板紫外/熒光（PE公司，美國），流式細(xì)胞計數(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM；Coulter公司，美國），LightCycler檢測儀（Roche公司，德國）。1.2浸提液制備

按文獻(xiàn)[3]制得4組nHA-PEA復(fù)合材料，按其無機(jī)和有機(jī)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分組，分別為A組0和100%，B組10%和90%，C組20%和80%，D組30%和70%。將4組nHA-PEA復(fù)合材料（平均厚度0.5～1 mm）消毒滅菌后，按照國際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO 10993-5醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)所推薦的試樣表面積和浸提介質(zhì)為6 cm2·mL－1的比例[4]，置37℃濾除細(xì)菌的培養(yǎng)液中，浸提3～4 d的浸提液備用。

1.3成骨細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞懸液的制備

取生長穩(wěn)定的第4代SD乳鼠顱骨成骨細(xì)胞，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰酶消化后行細(xì)胞計數(shù)，用DMEM配制5×104個每毫升的細(xì)胞懸液。

1.4甲噻唑四唑氮比色

將200μL密度為5×104個每毫升的細(xì)胞懸液加入96孔板，置于體積分?jǐn)?shù)5%的二氧化碳培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后棄掉原有培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為試驗組（A～D）和對照組（E），試驗組每組均分別加入200、100、50μL終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100%、50%和25%的浸提液，形成A1、

A2、A3，B1、B2、B3，C1、C2、C3，D1、D2、D3，

對照組加入原培養(yǎng)液。每日于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，生長和增殖情況。分別于第1、3、5、7 d各取96孔板1塊，每孔加入20μL的MTT，孵育4 h，每孔加入200μL二甲基亞砜，振蕩1 min，混勻，570 nm波長下測定各孔吸光度（A），取3孔均值，計算細(xì)胞增殖率（proliferation rate，RP）：RP=（A試驗組/A對照組）×100%。1.5流式細(xì)胞計數(shù)

接種對數(shù)生長期的成骨細(xì)胞1×105個每毫升瓶，細(xì)胞貼壁后A～D組棄原培養(yǎng)液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為100%的復(fù)合材料浸提液，E組加入新鮮原培養(yǎng)液，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下3 d換液1次，培養(yǎng)7 d，消化、離心并收集沉淀細(xì)胞。流式細(xì)胞計數(shù)DNA熒光強(qiáng)度及散光參數(shù)，Multicycle軟件分析細(xì)胞的周期分布和程序性死亡情況。1.6堿性磷酸酶活性檢測

取1×105個每毫升的細(xì)胞懸液3 mL加入小號培養(yǎng)瓶，將其置于體積分?jǐn)?shù)5%的二氧化碳培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后棄掉原有培養(yǎng)液，A～D組均加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%的浸提液，E組加入新鮮原培養(yǎng)液，分別于第4天和第7天中止培養(yǎng)，收集80μL細(xì)胞懸液，以AKP試劑盒通過HTS 7000plus多孔板高效分析儀行AKP活性測試。

1.7成骨細(xì)胞與材料的復(fù)合培養(yǎng)

將載有nHA-PEA復(fù)合膜的血蓋片試樣置于6孔板內(nèi)，環(huán)氧乙烷冷消毒，磷酸緩沖鹽溶液浸泡清洗3次，每次1 h，DMEM孵育過夜備用。取1×105個每毫升的細(xì)胞懸液，分別接種于已準(zhǔn)備好的材料上，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%的二氧化碳孵箱繼續(xù)靜置培養(yǎng)5 d。分別于第1天和第5天將試樣取出，以體積分?jǐn)?shù)10%的多聚甲醛固定，體積分?jǐn)?shù)30%～100%的乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換乙醇，臨界點(diǎn)干燥，表面噴金，SEM下觀察。1.8統(tǒng)計學(xué)分析

使用單因素方差分析，分析各組總體均數(shù)間差別有無統(tǒng)計學(xué)意義，在檢驗數(shù)據(jù)之前對數(shù)據(jù)行方差齊性檢驗。用q檢驗比較兩組間均數(shù)的差別。P>0.05為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞生長觀察及甲噻唑四唑氮比色結(jié)果

顯微鏡下，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的nHA-PEA復(fù)合材料浸提液組及對照組細(xì)胞培養(yǎng)6 h后均已貼壁，12 h細(xì)胞突逐漸舒展，24 h細(xì)胞開始鋪展，72 h后細(xì)胞數(shù)目明顯增多，排列規(guī)則密集，細(xì)胞呈梭形、三角形或不規(guī)則形，形態(tài)分析各試驗組與對照組細(xì)胞形態(tài)相似，顯示各組細(xì)胞均生長良好。試驗組和對照組不同時間的MTT比色結(jié)果見表1。試驗組間的MTT值及其與其對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；試驗組成骨細(xì)胞的相對增殖率為92%～107%，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的nHA-PEA復(fù)合材料浸提液組對成骨細(xì)胞的細(xì)胞毒性級數(shù)為0～

1級（0級：細(xì)胞相對增殖率大于等于100%，1級：細(xì)胞相對增殖率為90%～99%）[5]，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)浸提液組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

在生物醫(yī)學(xué)材料的細(xì)胞毒性試驗方法中，最常用的是材料浸提液培養(yǎng)法和細(xì)胞材料直接接觸法。本試驗綜合運(yùn)用了這兩種方法，首先選擇浸漬法，具體原因如下。1）對于nHA-PEA復(fù)合材料，nHA的生物相容性勿庸置疑；而PEA是新型的人工合成的生物降解型高分子材料，其理化性能和降解性能已有相關(guān)研究[6]，但其生物相容性鮮有報道。2）由于直接接觸法共同培養(yǎng)時，細(xì)胞對材料表面和對培養(yǎng)孔板底部的黏附性有差異，細(xì)胞洗脫率的不同會產(chǎn)生干擾而使試驗復(fù)雜化。事實(shí)上，僅需考察nHA-PEA復(fù)合材料溶出物的

細(xì)胞毒性，就可以達(dá)到初步評價其生物相容性的目的，而且以材料的浸提液代替材料本身在材料學(xué)的研究中已得到公認(rèn)。本試驗嚴(yán)格按照國際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO 10993-5醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)和要求制備生物醫(yī)學(xué)材料浸提液[4]，以浸提出最大量的濾出物質(zhì)，考察其對成骨細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。

MTT比色是常用的細(xì)胞增殖能力檢測方法，可以對材料的細(xì)胞毒性作出可靠的定量評價[5]。本試驗在相差倒置顯微鏡下觀察到nHA-PEA復(fù)合材料浸提液不影響細(xì)胞的生長形態(tài)；MTT值在試驗組間以及各組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，試驗組的細(xì)胞增殖率在92%～107%，表明nHA-PEA復(fù)合材料浸提液對成骨細(xì)胞的生長無不良影響。因此在進(jìn)一步地對細(xì)胞周期和功能進(jìn)行的分析中，僅選用最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的nHA-PEA復(fù)合材料浸提液作為試驗組進(jìn)行分析比較。在加入HA的試驗組，MTT值略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義且無量效關(guān)系。原因可能與其中的鈣、磷水平較高有關(guān)。

流式細(xì)胞計數(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域，細(xì)胞周期檢測已成為生物材料生物相容性評價的一種可靠方法和指標(biāo)[7]，是常規(guī)細(xì)胞增殖試驗的一項重要補(bǔ)充。近年來，生物材料生物相容性研究進(jìn)展之一是生物材料的生物功能性評價[8]。生物材料作用于細(xì)胞后使其周期改變，從而使其行為和功能發(fā)生改變。本試驗在MTT比色的基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用流式細(xì)胞計數(shù)，旨在從細(xì)胞增殖周期的角度來分析nHA-PEA復(fù)合材料浸提液對細(xì)胞增殖周期DNA合成的影響，從分子水平上評價材料的細(xì)胞毒性。從MTT比色可見，組間、組內(nèi)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的nHA-PEA復(fù)合材料浸提液對成骨細(xì)胞的增殖和增殖周期影響不大，細(xì)胞周期各亞期組成比和程序性死亡率差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。B、C、D組處于S期的細(xì)胞略多，表明加入HA對細(xì)胞增殖有一定促進(jìn)作用，但不顯著，不存在量效關(guān)系。此結(jié)果與MTT比色結(jié)果一致。

除了對細(xì)胞增殖的影響，生物材料的細(xì)胞相容性還表現(xiàn)在材料對細(xì)胞重要功能的影響。AKP是骨形成所必需的酶，是生物礦化和成骨細(xì)胞分化成熟的早期標(biāo)志物[9-10]：其表達(dá)代表骨形成狀況，表明細(xì)胞分化的開始，并隨細(xì)胞分化的發(fā)展而增強(qiáng)；其活性的高低，反映了相應(yīng)細(xì)胞向成骨方向化的趨勢。本研究采用酶聯(lián)法對成骨細(xì)胞AKP的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示試驗組AKP的表達(dá)量與對照組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明nHA-PEA復(fù)合材料對成骨細(xì)胞的功能酶表達(dá)無不良影響，也沒有明顯的促進(jìn)作用，不抑制其分化功能。

用浸提液作為試驗樣品測定復(fù)合材料中濾出物質(zhì)對細(xì)胞生長、增殖的影響，僅為預(yù)測材料植入體內(nèi)的潛在危害提供了初步依據(jù)，其結(jié)果尚有一定的局限性；因此，需在浸漬試驗良性結(jié)果的基礎(chǔ)上再采用直接法將成骨細(xì)胞與材料聯(lián)合培養(yǎng)，以進(jìn)一步考察材料本體的結(jié)構(gòu)性能對細(xì)胞生物學(xué)的影響。本研究表明，成骨細(xì)胞在復(fù)合材料上具有良好的黏附、鋪展和增殖行為，即nHA-PEA復(fù)合材料具有成骨細(xì)胞相容性和良好的細(xì)胞相容性等特性。

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篇4

HA是一種天然的高分子直鏈多糖,它是由N-乙酰基-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替連結(jié)而成的線型多糖。廣泛分布在動物和人體組織及細(xì)胞外基質(zhì)中,在眼玻璃體、房水、滑液、皮膚和臍帶中含量較高。被認(rèn)為是一種填充空間、穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、涂層細(xì)胞和保護(hù)細(xì)胞的多糖。其主要生物作用是穩(wěn)定細(xì)胞間纖維和膜蛋白結(jié)構(gòu),粘彈性的HA溶液對細(xì)胞及細(xì)胞間基質(zhì)的影響,形成了目前HA在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的基礎(chǔ)。對于增加HA的粘彈性和更好的固體性的需要,使開發(fā)它的交聯(lián)衍生物顯得尤為必要。交聯(lián)的衍生物不僅具有更好的流變性能,而且仍保持良好的生物相容性。

2透明質(zhì)酸衍生物

HA多糖鏈中含有三種能被衍生的官能團(tuán)類型,即羥基、羧基和乙酰氨基。由于聚合物的分子量很高,一般不考慮這些殘留的端基,用不同的化學(xué)試劑和這些官能團(tuán)反應(yīng)能得到許多HA衍生物,而各種HA衍生物的實(shí)際意義是由它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上的應(yīng)用決定的。

2.1羥基改性

羥基改聯(lián)的HA衍生物(羧基和乙酰氨基不參加反應(yīng))被稱為hylan。在反應(yīng)中使用各種不同官能團(tuán)的交聯(lián)劑,其中包括甲醛、二羥甲基脲、二羥甲基乙基脲、聚異氰酸酯以及乙烯基砜,在不同的基質(zhì)中分別可得到形狀為粉末、薄膜或涂層的不溶于水的制品。用二乙烯基砜(divinylsultone,DVS)作為交聯(lián)劑,可得到性能變化很大的HA類凝膠。在室溫下,DVS砜很容易和HA堿性水溶液反應(yīng)而生成交聯(lián)的HA凝膠,這個反應(yīng)進(jìn)行得很快,在幾分鐘內(nèi)能得到濃厚的凝膠。這些凝膠在水及含水的介質(zhì)中膨脹,膨脹率依賴于凝膠的交聯(lián)度,交聯(lián)度可以通過改變HA的分子量,HA在反應(yīng)混合物中的濃度,堿的濃度以及HA/DVS比率來控制。一般用DVS改性得到的HA凝膠擁有特殊的生物相容性和其它有用的性能,使它們成為醫(yī)學(xué)應(yīng)用上極好的產(chǎn)品。用醛作為交聯(lián)劑,可得到唯一可溶的HA衍生物(HA流體)。在從動物組織,如公雞的雞冠中提取HA之前,用一種能與蛋白質(zhì)及HA在水性介質(zhì)中反應(yīng)的物質(zhì)處理該組織,這種物質(zhì)包括甲醛、戊二醛、乙二醛等,但最好是甲醛。此時,HA被化學(xué)修飾。從動物組織中抽提HA時,首要問題是去除蛋白,而用甲醛處理后的HA溶液中的蛋白含量比未處理的HA溶液的蛋白含量低得多,并且HA分子量也大大增加,其溶液(HA流體)表現(xiàn)出很高的粘彈性。在堿性介質(zhì)及有機(jī)溶劑存在時,用多官能團(tuán)的環(huán)氧化合物作交聯(lián)劑,可得到水溶性的交聯(lián)的HA。根據(jù)反應(yīng)條件,特別是多環(huán)氧化合物與HA的比例,也能得到不溶于水的交聯(lián)HA,最終聚合物的溶解度是由交聯(lián)度決定的。不溶于水的HA凝膠被推薦用作玻璃體替代物以及用于視網(wǎng)膜剝離手術(shù)。

2.2羧基改性

上述方法得到的HA衍生物是以HA的羥基和交聯(lián)劑反應(yīng)得到的,通過用交聯(lián)劑和HA的羧基反應(yīng)也能得到HA衍生物如酯和胺。例如:在二甲基亞砜中,HA的四丁基銨鹽和碳與鹵素原子直接連接的任何物質(zhì)反應(yīng)生成酯,這些HA酯被推薦用在醫(yī)學(xué)上,包括藥物緩釋、皮膚疾病等的治療。在親核試劑或聚陰離子多糖(除HA外)不存在時,用碳化二亞胺和HA反應(yīng)制備不溶于水的生物相容性凝膠、薄膜和海綿[2]?？梢酝ㄟ^用二碳化二亞胺進(jìn)行交聯(lián)和用一碳化二亞胺對HA進(jìn)行化學(xué)修飾而減小它在體內(nèi)的水溶性和擴(kuò)散性。在用單官能團(tuán)的化學(xué)試劑時,最終產(chǎn)物不是交聯(lián)的,它的不溶性是通過引入疏水性的烷基酯得到的,這類產(chǎn)品被推薦用于防止手術(shù)后粘連、藥物緩釋等。而用二官能團(tuán)的化學(xué)試劑交聯(lián)的HA是一種水凝膠,它擁有不影響其生物相容性的新的藥物結(jié)合區(qū)域,這些交聯(lián)的化合物作為生物材料和藥物輸送的相對不溶性的基質(zhì)是非常有用的。

3透明質(zhì)酸的臨床應(yīng)用

3.1粘連性手術(shù)

HA最初的醫(yī)學(xué)應(yīng)用是在眼科領(lǐng)域,并已公認(rèn)HA凝膠的應(yīng)用是眼科顯微手術(shù)中的一大里程碑。HA作為粘連性手術(shù)器械的目的是在手術(shù)期間保護(hù)組織,并且給手術(shù)提供一個讓出空間和移動組織的安全工具,在手術(shù)后,當(dāng)被留在手術(shù)部位時,它們變成粘連性手術(shù)植入物,保證組織表面的分開,提供一個防止手術(shù)后滲出的屏障。粘連性手術(shù)植入物的功效是以它們的粘彈性為基礎(chǔ)的,粘連性手術(shù)植入物最重要的性能除它們的流變性能外,還有生物相容性。HA作為粘連性手術(shù)器械主要用于白內(nèi)障手術(shù),現(xiàn)在HA凝膠已被廣泛用于白內(nèi)障囊內(nèi)外摘除術(shù)、人工晶體植入術(shù)、視網(wǎng)膜剝離術(shù)和角膜移植術(shù)等多種眼科手術(shù)中[3、4]。在移去白內(nèi)障晶狀體及進(jìn)行人工晶體移植時,它能減少手術(shù)損傷;在玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)后,它也可用作玻璃體的替換物。最新交聯(lián)的HA凝膠在臨床實(shí)驗中被用作玻璃體的替換物,并證明了HA凝膠能成功地實(shí)現(xiàn)脫落視網(wǎng)膜的長期持續(xù)的再附著;并且由于hylan流體的粘彈性是相同濃度HA溶液的幾倍,所以在眼科學(xué)上正在探索hylan流體作為更有效的粘彈性工具。

3.2關(guān)節(jié)炎治療

70年代前期,粘性填充物已作為一種新的治療形式而被應(yīng)用到醫(yī)學(xué)上。在各種形式的關(guān)節(jié)炎中,特別是骨關(guān)節(jié)炎中,關(guān)節(jié)軟組織內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)的粘彈性下降,這種下降是由HA的濃度下降和分子量下降,從而降低了關(guān)節(jié)滑液的生理性保護(hù),沖擊吸收等功能。當(dāng)使用HA時,關(guān)節(jié)液的低粘彈性立即升高,疼痛減輕,關(guān)節(jié)的靈活性增加,并且流變性能通常能恢復(fù)到正常水平,而且外源性的HA注射在關(guān)節(jié)腔內(nèi),改善了關(guān)節(jié)腔的生物環(huán)境,促進(jìn)患者自身體內(nèi)合成高分子量的HA[5]。粘彈性物補(bǔ)充療法在治療膝關(guān)節(jié)炎中用HA表現(xiàn)出一種安全的方式,但為了達(dá)到療效通常要進(jìn)行多次注射,可能是HA制劑缺乏足夠的粘彈性或在關(guān)節(jié)中代謝太快的緣故。這兩種性能可以通過增加HA的分子量來提高。交聯(lián)的HA被開發(fā)作為骨關(guān)節(jié)炎滑液粘彈性物補(bǔ)充療法的治療制劑,它具有更好的粘彈性以及更長的關(guān)節(jié)內(nèi)滯留時間,并且通過臨床實(shí)驗證明了它的有效性和安全性[6、7]。HA已成為臨床上治療各種骨關(guān)節(jié)病的首選生物醫(yī)學(xué)材料。

3.3防止粘連

HA和它的衍生物在手術(shù)后防止組織粘連中的應(yīng)用已得到了廣泛的重視,其應(yīng)用效果在國內(nèi)外的大量臨床實(shí)踐中得到了證明[8]。在手術(shù)期間或手術(shù)后,在手術(shù)部位組織間引入HA凝膠、薄膜或海綿來分離正愈合的組織或者防止正愈合的組織術(shù)后粘連,而不會影響傷口的愈合。在一段合適的時間后,HA凝膠、薄膜或海綿將擴(kuò)散或降解。但必須保持在合適的位置,并在一個長時間內(nèi)防止組織接觸,以便當(dāng)HA凝膠、薄膜或海綿擴(kuò)散或降解,組織開始接觸時,不再有粘連的趨勢。生物相容性的HA凝膠、薄膜和海綿防止粘連的手術(shù)包括:在腹部區(qū)域進(jìn)行的手術(shù)中,防止腸或腸系膜粘連;在涉及肌腱的手術(shù)中,在手術(shù)后的定位期間,防止肌腱和周圍膜或其它周圍組織間的粘連。在眼科手術(shù)中,它被用在眼前房防止角膜和虹膜間的虹膜粘連,特別是用于神經(jīng)受損后的重修,而且可降解的或永久的移植片在青光眼手術(shù)或斜視手術(shù)后防止粘連效果也較滿意。

3.4藥物緩釋

HA及其衍生物已被研制作為有生物活性的分子的被控和定位的藥物載體,并且具有緩釋作用[9]。HA是一種具有特殊的生物相容性和獨(dú)特的流變性能的天然多糖,化學(xué)改性的HA既保留了天然HA的生物相容性,又提供了各種釋放體系的主要成份,當(dāng)改性的HA用作載體來緩釋有藥物活性的物質(zhì)到動物機(jī)體所需部位時,有藥物活性的物質(zhì)被選擇與改性的HA共價結(jié)合形成一個能控制釋放的藥物緩釋體系;另一方面,有藥物活性的物質(zhì)也能與改性的HA非共價相互作用。HA及其衍生物對各種有藥理活性分子的優(yōu)先釋放能力可在體外和體內(nèi)測定。HA緩釋體系的治療藥物可以是水溶性的或非水溶性,陰離子或陽離子型,只要它們能與HA上的基團(tuán)形成共價鍵或離子鍵等相互作用,HA緩釋體系特別適合于控制生長因子(白細(xì)胞素、前列腺素等)、固醇類、抗生素、止痛藥、、防腐劑等多種藥物。HA緩釋體系能以多種形式如靜脈注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射、皮下注射等引入體內(nèi)。HA及其衍生物載體能提供獨(dú)特的生物相容性、流變性能及化學(xué)和物理多樣性,是一種有藥理活性分子的有效緩釋體系,HA和各種藥物結(jié)合將是HA臨床應(yīng)用的重點(diǎn)。

3.5軟組織的增大

一種非水溶性的、可注射的、可移植的HA衍生物被研制用于軟組織的修補(bǔ)和增大。由于改性的HA的生物相容性,非致炎性和致免疫反應(yīng),其交聯(lián)結(jié)構(gòu)和水不溶性限制了它的擴(kuò)散和遷移作用以及其流變性能,使其在泌尿科學(xué)、皮膚病學(xué)及胸部增大中用作軟組織增大的一種安全、有效的替代物。

3.6經(jīng)皮的栓塞治療

經(jīng)皮的栓塞形成已有效地用于治療血管損傷、動脈瘤及腫瘤。在此應(yīng)用中,實(shí)現(xiàn)纖維蛋白酶的局部血管內(nèi)輸送是為了通過催化纖維蛋白原到纖維蛋白的聚合,引起快速、局部的血凝塊的形成。初步的人體內(nèi)實(shí)驗證明改性的HA凝膠栓塞形成劑能形成完整的和長期的動脈阻塞[10]。

篇5

[關(guān)鍵詞]3Y-TZP；生物相容性；體外細(xì)胞毒實(shí)驗

[中圖分類號]R783[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2008）03-03

Preliminary evaluation on biocompatibility ofall-ceramic dental material:3Y-TZP

LI Guo-hua1,GONG Zhen-yu1,YU Shu-xiang2,CHEN Ji-hua3

(1.Department of Stomatology, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou 350025,Fujian,China)

Abstract: Objective To preliminarily evaluate the biocompatibility of 3Y-TZP which were used as a new dental all-ceramic materials. Methods According to ISO standards, in vitro cytotoxicity-test (MTT method) on L-929 cell were carried on. Results The OD-value of each test group were similar to the negative control and significantly different from positive control which indicated that the materials tested were safe to L-929 cells. Conclusion It is preliminarily estimated that 3Y-TZP is a safe material for dental clinical application.

Key words：3Y-TZP;biocompatibility;vitro cytotoxicity-test(MTT method)

隨著人們對審美要求的不斷提高，越來越多的修復(fù)專業(yè)人士及患者樂于接受色澤逼真，無齦緣灰線的全瓷修復(fù)體。以往的全瓷材料因脆性大使其臨床應(yīng)用尤其是后牙橋、多單位長橋受到限制，氧化鋯具有應(yīng)力誘發(fā)相變增韌性能而被稱為韌性陶瓷，是最有希望替代金屬烤瓷的全瓷材料[1-2]。目前國內(nèi)外的此類產(chǎn)品研究方興未艾。良好的生物相容性是生物材料包含牙科材料得以應(yīng)用的重要前提，也是保證臨床安全的重要技術(shù)指標(biāo)。因此針對這種材料的生物學(xué)評價是十分必要和重要的。本研究采用體外細(xì)胞毒性試驗的方法檢測該材料對細(xì)胞生長狀況的影響，從而初步評價其生物相容性。

1材料和方法

1.1實(shí)驗材料：3mol%氧化釔穩(wěn)定的四方多晶氧化鋯（3Y-TZP）全瓷材料試件；受試細(xì)胞株：小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞（L-929細(xì)胞），ISO推薦；主要試劑與設(shè)備：①M(fèi)TT：全稱為3-（4，5-二甲基噻唑基-2）-2，5二苯基四氮唑溴鹽（Sigma，USA）；實(shí)驗前用PBS（0.01mol/L，pH值7.4）新鮮配制，0.22μm微孔濾菌器過濾除菌；②DMSO（西安化學(xué)試劑廠）：全稱為二甲基亞砜；③DMEM培養(yǎng)液，10%小牛血清；④BioRAD Model-550酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀；⑤Heraus二氧化碳孵箱；⑥Olympus IX-70倒置相差顯微鏡。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1陶瓷材料浸漬液的制備：將實(shí)驗材料所作試件打磨圓鈍后，無水乙醇超聲清洗20min，干燥后在121℃，33MPa壓力下滅菌處理后放入無菌培養(yǎng)皿，加入10mlDMEM培養(yǎng)液（表面積與浸提液之比為1.5cm2/ml）后置于37℃培養(yǎng)箱中浸泡24h，制成浸提液。完成后用DMEM培養(yǎng)液分別稀釋，制備100%、50%、25%、12.5%的浸提液，放入4℃冰箱保存。

1.2.2凍存L-929細(xì)胞復(fù)蘇后經(jīng)過兩次傳代，生長情況穩(wěn)定。取對數(shù)生長期的受試細(xì)胞系，胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度約1 000個/ml，接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板（200μl/孔，n=4）置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，在飽和濕度條件下培養(yǎng)24h。

1.2.3準(zhǔn)備4塊96孔培養(yǎng)板，分別用于連續(xù)培養(yǎng)1、2、4、8天組。每塊培養(yǎng)板按照陰性對照，4個不同濃度的實(shí)驗組，陽性對照，空白對照組（調(diào)零）劃區(qū)分組，每組樣本5孔。

1.2.4觀察細(xì)胞貼壁良好后，棄去原培養(yǎng)液，按照實(shí)驗分組分別將當(dāng)日要用的不同濃度的材料浸提液按10%的濃度加入小牛血清，后加入各實(shí)驗組（200μl/孔），陰性對照為DMEM培養(yǎng)液，加入血清的培養(yǎng)液，單純浸提液。陽性對照為0.1%苯酚，常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.5 MTT檢測：分別培養(yǎng)1、2、4、8天（其中4天與8天組需要隔3天換液一次），終止培養(yǎng)前4h加入0.5%MTT（20μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入DMSO150μl置于室溫下15～20min，震蕩培養(yǎng)板10min使染色均勻，采用酶聯(lián)檢測儀在490nm波長測定各孔光吸收值（OD值），計算出各組的均值。

1.2.6采用倒置相差顯微鏡，觀察細(xì)胞形態(tài)，于MTT檢測前對細(xì)胞照相。

1.2.7評價方法：計算出每種材料的陰性對照和各濃度組的OD均值（n=4）。以陰性對照的OD值作為100%細(xì)胞增殖率，則各濃度組的細(xì)胞增殖百分率可依式P%=各濃度組OD均值/陰性對照組OD均值×100%求出，將浸提液各濃度組的P%轉(zhuǎn)化為0～5級細(xì)胞毒性：

2結(jié)果（見表1～4，圖1～4）

培養(yǎng)同樣的培養(yǎng)時間各濃度實(shí)驗組的OD值之間沒有明顯的差異（P＞0.05）；隨培養(yǎng)時間延長，各濃度組OD值都逐漸增高，不同濃度的各實(shí)驗組與陰性對照組之間無顯著性差異（P＞0.05）；各實(shí)驗組均與陽性對照組有顯著差異（P＜0.01）?？梢哉J(rèn)為實(shí)驗材料細(xì)胞毒性分級與陰性對照同為0級，陽性對照毒級為5級。根據(jù)細(xì)胞增殖曲線可見：各濃度實(shí)驗組的細(xì)胞增殖曲線都與陰性對照組走勢相似，與陽性對照組差別明顯。

圖2～4分別為MTT檢測前陰性對照組8天、100％濃度的實(shí)驗組培養(yǎng)8天及陽性對照組培養(yǎng)1天細(xì)胞的照片?？梢妼?shí)驗組細(xì)胞形態(tài)良好，為長梭形和多角形，并可見圓形分裂細(xì)胞，表明細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞折光性強(qiáng)，與陰性對照組相似。陽性對照組正常細(xì)胞形態(tài)消失，核固縮或溶解，漂浮在培養(yǎng)液中。染色后，實(shí)驗組MTT結(jié)晶物密度與陰性對照組相似，呈現(xiàn)為透明的藍(lán)紫色，陽性組染色后變色不明顯。

3討論

為了檢測牙科材料的生物相容性，細(xì)胞毒性實(shí)驗常常是材料初選時的必測項目[3]。本實(shí)驗采用間接接觸方法，通過細(xì)胞的增殖率來測定細(xì)胞的生長增殖情況，從而間接檢測材料對細(xì)胞的毒性作用。在正常培養(yǎng)基中，L-929細(xì)胞通過有絲分裂呈指數(shù)增長，當(dāng)有外來因素影響其生長時，則會出現(xiàn)細(xì)胞粘附力、細(xì)胞生物合成活性及細(xì)胞增殖率的下降，嚴(yán)重時可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。本實(shí)驗基于此原理，通過材料對細(xì)胞增殖率的影響大小，來判定材料的體外細(xì)胞毒性程度。

MTT法的原理是生活細(xì)胞線粒體上的琥珀酸脫氫酶可與外源性的MTT發(fā)生氧化還原反應(yīng)，被還原成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶物沉積于細(xì)胞內(nèi)，而死細(xì)胞無此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，然后酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定光吸收值，就可以間接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量[5]。目前國際上在評價一種細(xì)胞毒性實(shí)驗方法時，往往把該方法的生物學(xué)終點(diǎn)和其證實(shí)過程放在首位，即看該方法最終測定的是細(xì)胞哪個方面的生物學(xué)變化。如觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞核計數(shù)及測定細(xì)胞的酶活性改變等。MTT試驗法的生物學(xué)終點(diǎn)是重要的細(xì)胞器-線粒體，線粒體在細(xì)胞的生命活動中是一個能量供應(yīng)站，其數(shù)目在細(xì)胞生命活動旺盛時增多，衰退時則減少。線粒體病變被認(rèn)為是表示細(xì)胞受損傷最靈敏的指征。MTT試驗法用線粒體作為其生物學(xué)終點(diǎn)，可以十分靈敏地反映出被測試材料對細(xì)胞造成的毒性損害程度。

MTT試驗法具有通用性，廣泛用于各種器械材料的評價。通?？梢愿鶕?jù)生活細(xì)胞的數(shù)量，細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，死亡分解的細(xì)胞數(shù)量和彌散范圍等方面來衡量，將細(xì)胞增殖度法與細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察相結(jié)合，可以更加有效地評價材料的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性與被測材料的量尤其是表面積有關(guān)[6]，本實(shí)驗為此設(shè)計了不同濃度的浸提液比較，其統(tǒng)計結(jié)果無顯著性差異，也從側(cè)面說明本實(shí)驗材料對細(xì)胞沒有毒性。

4結(jié)論

從毒性評級比較，本實(shí)驗所檢測的3Y-TZP全瓷材料的毒級為0級，可認(rèn)為對細(xì)胞無毒，即該材料屬于惰性材料，不會干擾生物細(xì)胞的正常功能，可以初步認(rèn)為該材料對人體是安全的。

[參考文獻(xiàn)]

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[5]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods,1983,65(1-2):55-63.

篇6

【關(guān)鍵詞】 骨支架材料； 生物衍生骨； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

Experimental Study of Rabbit Bone Mesenchymal Stem Cells With Xenogeneic Biological Derivative Cancellous Bone/XIAO Shi-hui，WEI Qing-jun，WEI Ji-hua，et al.//Medical Innovation of China，2012，9(13)：003-005

【Abstract】 Objective：To explore good bone tissue engineered scaffold.Methods：To made biological derivative bone material with fresh pig femoral，then coculture with rabbit bone mesenchymal stem cells，the cell attachment and growth were detected to evaluate the celluar compatibility to biomaterial.Results：Xenogeneic biological derivative cancellous bone have 3D porous structure，meanwhile have good biocompatibility and material-cell interface.Conclusion：There are bright prospects in clinic application for the xenogeneic biological derivative cancellous bone，applicable to the construction of the bone tissue engineering.

【Key words】 Bone scaffold material; Biological derived bone; Bone mesenchymal stem cells

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2012.14.002

創(chuàng)傷、腫瘤術(shù)后等原因常常造成大段骨缺損、肢體功能喪失。為了滿足修復(fù)治療的需要，眾多研究者摸索了大量修復(fù)骨缺損的方法，目前組織工程提供了一個新的途徑，運(yùn)用組織工程的方法，以支架材料為載體，復(fù)合分離的種子細(xì)胞，在體外預(yù)先構(gòu)建有生命的種植體，植入體內(nèi)以修復(fù)組織缺損，替代后重建器官結(jié)構(gòu)，維持改善組織器官功能。本實(shí)驗從探尋良好的骨組織工程支架材料的目的出發(fā)，擬制備一種生物骨衍生材料，將此材料與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)體外復(fù)合培養(yǎng)，通過電鏡對復(fù)合培養(yǎng)過程進(jìn)行動態(tài)觀察，了解該材料與BMSCs的生物相容性及黏附情況，尋找一種有臨床應(yīng)用前景，適用于構(gòu)建組織工程骨的支架材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 純種新西蘭大白兔1只，4周齡，體重1.5 kg，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心。

1.2 主要儀器 培養(yǎng)箱(HERACAN 150i)，超凈工作臺(蘇凈)，倒置顯微鏡(OLympus CKX41)，離心機(jī)(上海飛鴿)，VEGA3 TESCAN掃描電鏡(捷克)，低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，胎牛血清(杭州四季青公司)，0.25%胰蛋白酶(吉諾)。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 生物衍生骨的制備 取新鮮市售新鮮豬股骨，剔除周圍軟組織、骨膜和關(guān)節(jié)軟骨，保留松質(zhì)骨，再將其制成1 cm×0.4 cm×0.3 cm的骨條，經(jīng)脫蛋白、脫脂、脫鈣后制成生物衍生骨，-80 ℃深低溫冰箱保存48 h后，經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒，-4 ℃保存?zhèn)溆?。取部分骨支架做掃描電鏡觀察支架形態(tài)[1]。

1.3.2 兔BMSCs的分離 3%戊巴比妥鈉按1 ml/kg劑量經(jīng)兔耳緣靜脈行全身麻醉。常規(guī)消毒鋪巾，于雙側(cè)股骨近端及脛骨近端作骨穿(注射器內(nèi)含0.2 ml的肝素鈉200 U/ml)，抽取骨髓4~5 ml，抽出的骨髓血立即用等量的PBS洗滌后，離心1000 r/min，離心5 min，棄去上清液，重復(fù)上述操作2次后，接種于50 ml的培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后全量換液，去除懸浮細(xì)胞。原代培養(yǎng)細(xì)胞長滿瓶底面積80%~90%時，加入0.25%胰蛋白酶消化2~3 min，加含血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。1000 r/min離心5 min，棄上清液，以1∶3接種。

1.3.3 細(xì)胞與支架的復(fù)合 無菌條件下取第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，以胰蛋白酶消化細(xì)胞后吹打制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量約為2×106/ml，用微量移液槍將細(xì)胞懸液250 μl滴入預(yù)濕處理過的生物骨衍生材料松質(zhì)骨面上，使之充分滲入。預(yù)培養(yǎng)4 h后，小心加入含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基中復(fù)合培養(yǎng)，隔日換液，倒置顯微鏡及電鏡觀察復(fù)合培養(yǎng)的情況，了解材料與BMSCs的相容性及黏附情況。

1.3.4 細(xì)胞在材料上的增殖檢測 取處理后的異種骨支架24塊，以上述方法接種細(xì)胞。24 h后取復(fù)合物3塊用PBS沖洗材料，使未貼壁的細(xì)胞脫落，再用0.25%胰酶消化，計算附著于材料上的細(xì)胞數(shù)。以后每天取3塊材料按同樣的方法計數(shù)細(xì)胞連續(xù)計數(shù)8 d。

2 結(jié)果

2.1 異種生物衍生骨外觀呈乳白色，具有天然網(wǎng)架孔隙結(jié)構(gòu)。掃描電鏡下觀察孔隙不規(guī)則，生物衍生骨支架表面粗糙，可見大小不等的裂隙與微孔，并互通形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?？紫吨睆剑?50.8~306.7 μm，平均直徑：225.3 μm。孔隙率：84.5%~89.7%。見圖1、圖2。

圖1 支架外觀 圖2 掃描電鏡下支架外觀(×100)

2.2 倒置顯微鏡觀察原代培養(yǎng)的兔BMSCs呈成纖維細(xì)胞樣生長，細(xì)胞成梭形或多角形，細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)折光性好，但存在一部分雜細(xì)胞，通過多次換液后，傳代培養(yǎng)的BMSCs雜細(xì)胞數(shù)量明顯減少，逐漸形成細(xì)胞集落，并繞集落呈放射樣排列，表現(xiàn)出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長特點(diǎn)且生長力旺盛。見圖3、圖4。

圖3 原代培養(yǎng)的兔BMSCs(×100) 圖4 傳代培養(yǎng)的兔BMSCs(×100)

2.3 掃描電鏡(SEM)下觀察到復(fù)合培養(yǎng)的情況：復(fù)合培養(yǎng)3 d發(fā)現(xiàn)細(xì)胞附著與材料表面，細(xì)胞形態(tài)不均一，有的成梭形，有的細(xì)胞扁平狀平鋪于支架孔隙側(cè)壁有多個突起，見圖5。培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞生長連接成片呈層狀生長，細(xì)胞接觸緊密，見圖6。7 d后細(xì)胞多層生長，細(xì)胞生長成堆，部分區(qū)域有細(xì)胞外基質(zhì)分泌，見圖7。

2.4 細(xì)胞在支架材料的增殖能力 從描繪出來的增殖曲線可以看出，細(xì)胞在異種骨支架上的增殖情況與細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)時的生長情況相似。從曲線的變化可以看出，細(xì)胞與支架復(fù)合培養(yǎng)后，rBMSCs在接種的前2 d為細(xì)胞潛伏適應(yīng)期，第3~6天生長曲線基本為線性曲線，表明這段時間是細(xì)胞的對數(shù)生長期。第6天后曲線逐漸變得平緩，細(xì)胞增殖減慢，表明細(xì)胞增殖進(jìn)入平臺期。見圖8。

3 討論

在組織工程中，細(xì)胞與材料的復(fù)合是一項較為復(fù)雜的技術(shù)，細(xì)胞與材料的相互作用也是極為重要的，在構(gòu)建組織工程骨的過程中，細(xì)胞與材料的粘附是基礎(chǔ)，只有種子細(xì)胞與材料發(fā)生適當(dāng)?shù)卣掣剑拍苓M(jìn)一步發(fā)生增殖和分化。然而，細(xì)胞與材料的粘附作用受到材料的含水量、材料表面理化性質(zhì)、材料表面的改性處理、材料表面幾何性質(zhì)、表面特化結(jié)構(gòu)等因素的影響[2]。所以在實(shí)驗過程中應(yīng)該選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞外基質(zhì)作為組織工程骨支架材料。理想的支架材料必須要有具備如下特點(diǎn)[3]：(1)具有良好的三維立體多孔結(jié)構(gòu)；(2)吸收動力學(xué)與新的骨組織形成速率匹配，使局部負(fù)荷逐漸過渡到新生骨組織；(3)材料降解產(chǎn)物應(yīng)無毒且容易被機(jī)體排出，具有良好骨傳導(dǎo)及骨誘導(dǎo)作用，生物相容性好；(4)與宿主骨有相似的機(jī)械性能，能與之間形成穩(wěn)定的界面，局部不易誘發(fā)形成瘢痕組織；(5)可以耐受國際標(biāo)準(zhǔn)要求的對于用于臨床的骨支架的滅菌方法；(6)能夠制備與缺損組織形態(tài)相似的最佳的支架形態(tài)。

生物衍生骨支架材料主要指異體骨和異種骨材料，通過各種理化方法可以降低甚至基本消除其抗原性，因此，異種骨研發(fā)應(yīng)用的前景更為廣闊。處理過后天然生物衍生骨材料保留原有骨的骨小梁、小梁間隙及骨鹽支架的三維結(jié)構(gòu)，解決了其他骨支架材料的孔隙率、孔隙直徑大小、孔隙連通等方面的問題，因此，天然衍生骨材料具有良好的細(xì)胞材料界面。同時由于骨組織結(jié)構(gòu)的高度同源性，呈現(xiàn)良好的生物相容性。雷榮昌等[4]用兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后與豬松質(zhì)骨支架體外復(fù)合培養(yǎng)，通過掃描電鏡觀察豬松骨材料對成骨細(xì)胞生長、粘附的影響，發(fā)現(xiàn)松質(zhì)骨支架聯(lián)合培養(yǎng)1 d后，可見細(xì)胞附著于材料表面，但數(shù)量不多，細(xì)胞呈圓球形，7 d后細(xì)胞生長密集，似葡萄狀粘附于脫礦豬松質(zhì)骨的孔壁上，細(xì)胞呈不規(guī)則圓球形，細(xì)胞相互融合，可見細(xì)胞遮蓋微孔間隙。黨洪勝等[5]利用胎兔成骨細(xì)胞與經(jīng)肝細(xì)胞生長因子(HGF)修飾的異種脫蛋白松質(zhì)骨(DPB)進(jìn)行體外復(fù)合，電鏡發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞能夠在DPB表面附著及生長，且HGF/DPB對成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性有明顯的促進(jìn)作用，并能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。馬紹英等[6]將兔骨膜源性成骨細(xì)胞與凍干人松質(zhì)骨支架復(fù)合培養(yǎng)，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)體外復(fù)合培養(yǎng)3 d，細(xì)胞粘附伸展，個別部位有少量細(xì)胞增殖；培養(yǎng)1周，形成了由一層或幾層細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞膜片，覆蓋整個骨小梁網(wǎng)架表面；培養(yǎng)3周，所形成的細(xì)胞膜片已較厚，細(xì)胞表面有基質(zhì)分泌。四川大學(xué)華西醫(yī)院對異種骨的改進(jìn)做了一系列的研究，制成部分脫鈣骨(PDCB)、部分脫蛋白骨(PDPB)、復(fù)合型完全脫蛋白骨(CFDB)三種材料，三種材料都保持原骨組織的天然網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)，都有良好的生物相容性，分別與人胚骨膜成骨細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)，結(jié)果顯示三者都有良好的成骨性[7]。

本實(shí)驗采用異種骨通過脫蛋白、脫脂、脫鈣，深低溫冷凍制成生物骨衍生材料，將其與培養(yǎng)、擴(kuò)增后的兔BMSCs共同培養(yǎng)，實(shí)驗結(jié)果：電鏡下觀察支架具有三維孔隙結(jié)，BMSCs不僅能與生物骨衍生材料黏附，而且能在支架上分裂、增殖，表明此種方法制備的異種生物衍生骨材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外有較好的生物相容性和細(xì)胞材料界面，且具有骨誘導(dǎo)特性，是一種有臨床應(yīng)用前景的、適用于構(gòu)建組織工程骨的支架材料。

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篇7

【關(guān)鍵詞】 ，磷酸鈣骨水泥

Effects of chitosan on properties of selfmade calcium phosphate cement

【Abstract】 AIM: To investigate the effect of chitosan on the physical characteristics， ultramicrostructure and biocompatibility of a selfmade calcium phosphate cement (CPC). METHODS: Two different cement formulations were prepared by mixing CPC powder respectively with 50 g/L chitosan lactate and 1 mol/L dibasic sodium phosphate used as liquid phase. For physical properties， washout resistance， primary setting time and compressive strength were measured. Scanning electron microscopy (SEM) was used to examine the microstructure and the intramuscular implantation of a rat model and rat mesenchymal stem cells (RMSC) seeded on CPC disks were used to compare the biocompatibility of the two formulations. RESULTS: CPCchitosan composite was more stable in water than conventional CPC and it did not disintegrate within 3 min even when placed in water immediately after the mixing. The mean setting time was 8.38 min in CPCchitosan and 23.68 min in the control. The mean compressive strength of composite increased to 6.52 MPa， whereas the control samples exhibited much lower values (2.08 MPa). SEM examinations showed that globular and platy particles were formed on surfaces of all samples but the particles on the surface of the CPCchitosan composite seemed to connect together viscously， with smaller pores than those of control. Slight signs of inflammation， which disappeared after four weeks， were detectable around the specimens implanted within one week. After 12 weeks， the experimental implants became soft， while the controls remained the same in appearance. Necrosis was not detected in the muscles around the implants. SEM showed that cells adhered to CPCchitosan composite disks， but the visible amount of the adherent cells was greater than that of control. CONCLUSION: Chitosan is suitable for the stabilization of CPC in a wet environment for it accelerates the setting reaction and improves the mechanical properties and biocompatibility of the cements.

【Keywords】 calcium phosphate cement； chitosan； compressive strength； biocompatibility

【摘要】 目的：了解殼聚糖對自制磷酸鈣骨水泥（CPC）物理性能、超微結(jié)構(gòu)及生物相容性的影響. 方法：分別以50 g/L乳酸殼聚糖和1 mol/L磷酸氫二鈉為液相制備CPC試樣，通過防水試驗、測定初步凝結(jié)時間、抗壓強(qiáng)度；掃描電鏡觀察凝固體超微形態(tài)；大鼠肌肉植入及骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表面種植試驗比較兩者差異. 結(jié)果：復(fù)合殼聚糖的CPC在水中更穩(wěn)定，混合后即刻投入生理鹽水3 min內(nèi)不散開；平均初步凝結(jié)時間8.38 min，對照組23.68 min；平均抗壓強(qiáng)度6.52 MPa；對照組2.08 MPa. 掃描電鏡發(fā)現(xiàn)凝固體表面為顆粒狀及片狀晶體，實(shí)驗組晶體互相連接，孔隙較對照組少. 植入肌袋1 wk有輕微炎癥反應(yīng)，4 wk后反應(yīng)減退，12 wk后實(shí)驗組材料變軟，對照組外形基本未變. 肌肉無壞死. 電鏡下細(xì)胞可在水泥盤上貼附、生長， 實(shí)驗組可見的細(xì)胞數(shù)較多. 結(jié)論：CPC殼聚糖復(fù)合物在潮濕條件下更穩(wěn)定，固化時間縮短，抗壓強(qiáng)度提高，生物相容性更好.

【關(guān)鍵詞】 磷酸鈣骨水泥；殼聚糖；抗壓強(qiáng)度；生物相容性

0引言

骨缺損是困擾矯形、頜面、腦外科的一個常見而又棘手的難題. 自固化磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement， CPC）終產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與骨的礦物成份相似，具有良好的生物相容性、可降解性、骨傳導(dǎo)性，并且可隨意塑性，與周圍骨組織緊密連接等多種優(yōu)點(diǎn)［1］，因而得到材料界及醫(yī)學(xué)界的重視，成為骨缺損修復(fù)材料研究和應(yīng)用的一個熱點(diǎn). 但是普通CPC缺乏韌性、固化時間長、降解速度較慢、抗壓強(qiáng)度低等不足使其臨床應(yīng)用受到一定限制. 如何進(jìn)一步改性，更好地滿足臨床需要成為研究的焦點(diǎn). 研究發(fā)現(xiàn)改變其固相顆粒大小、液相、液固比例、溫度，添加適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)或聚合材料等方法可以在一定程度上改善其性能 ［2-5］.

殼聚糖（chitosan， CS）是地球上含量極為豐富，僅次于纖維素的天然聚合體―甲殼素的脫乙?；苌?，其結(jié)構(gòu)與硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等物質(zhì)類似，是一種由2氨基2脫氧βD葡萄糖通過β1，4糖苷鍵聚合的天然聚陽離子多糖. 研究表明CS可被包括溶菌酶在內(nèi)的多種特異或者非特異性酶降解為氨基葡萄糖而被吸收，并且具有生物相容性、止血、抗感染、可塑性及黏附性等諸多優(yōu)點(diǎn)［6］， CS單獨(dú)或者與復(fù)合其他材料可制作敷料、釋放藥物、基因的載體、生物涂層、組織工程支架等［7］. 我們擬研究CS對自制的自固化CPC性能的影響.

1材料和方法

1.1CPCCS復(fù)合物的制備參照文獻(xiàn)［8］所述方法制備無水磷酸氫鈣和磷酸四鈣，球磨過篩，前者平均粒徑1 μm，后者17 μm. 等摩爾比混合作為CPC固相. 液相：實(shí)驗組50 g/L乳酸殼聚糖（上海源聚生物公司)，對照組1 mol/L磷酸氫二鈉. 粉(g)∶液(mL)=2∶1.

1.2防水試驗用手將0.3 g CPC粉及0.15 mL液體揉合，作成小球，立即放入含4 mL 37℃生理鹽水內(nèi)的小瓶內(nèi)，比較肉眼可見的散開程度.

1.3初步凝結(jié)時間測定0.6 g CPC粉與0.3 mL液體在玻璃板上混合30 s后，置入直徑5 mm高12 mm玻璃管內(nèi)，塑料膜覆蓋管頂及管底，C型夾固定，置于相對濕度100%，37℃濕盒內(nèi)，定期取出用水泥凝結(jié)時間測定儀（上海東星建材實(shí)驗儀器有限公司）間隔不同時間測定. 從試針接觸試樣表面，讓滑桿自由滑下，至試針插入試樣不超過1 mm所需時間為水泥初步凝結(jié)時間（n=5）.

1.4抗壓強(qiáng)度測定標(biāo)準(zhǔn)抗壓試件為直徑比高度小于2的圓柱體. 0.6 g CPC粉與0.3 mL液體混合，裝入直徑5 mm高12 mm模具，直徑5.6 mm不銹鋼棒周期擠壓（壓力約19.6 N）. 脫模后，放入直徑8 mm高20 mm玻璃管內(nèi)，塑料膜封口， 37℃相對濕度100%的濕盒內(nèi)固化2 d. 標(biāo)本放在材料萬能試驗機(jī)量壓縮頭之間，抗壓測試加載至試件變形，記錄最大壓力，計算抗壓強(qiáng)度（n=5）.

1.5掃描電鏡分析樣品的形態(tài)力學(xué)測量后斷裂表面脫水干燥并經(jīng)真空鍍膜儀表面噴金，掃描電鏡(日產(chǎn)JSM35C型)觀察各樣本表面形態(tài).

1.6肌肉植入試驗0.2 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉動物后，背部正中縱行切口，小心分離脊柱兩側(cè)椎旁肌肉形成肌袋，各植入經(jīng)γ射線滅菌的實(shí)驗及對照組水泥柱一枚，分別于術(shù)后1 wk，1 mo，3 mo照相、取材，40 g/L多聚甲醛緩沖固定液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色. 每組4只SD大鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗動物中心）.

1.7細(xì)胞種植實(shí)驗及對照組分別制備成直徑10 mm，厚4 mm 的水泥盤，固化48 h后乙醇漂洗2次，γ射線滅菌. 取成骨性培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)的第2代大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，胰酶消化以1×105個/mL種植于水泥盤. 2 d后PBS液洗滌10 min， 10 g/L戊二醛固定，梯度乙醇脫水，真空干燥，噴金. 再次以掃描電子顯微鏡觀察.

統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，SPSS軟件兩獨(dú)立樣本t檢驗比較試樣初步凝結(jié)時間及抗壓強(qiáng)度. 檢驗水準(zhǔn)設(shè)為P＜0.05.

2結(jié)果

2.1防水試驗水泥小球放入裝有生理鹽水的瓶中，對照組產(chǎn)生較多水泡，很快散開；實(shí)驗組只有很少的水泡，可保持原來的外形3 min.

轉(zhuǎn)貼于

2.2水泥初步凝結(jié)時間測定實(shí)驗組(8.4±1.2) min，對照組(23.7±2.7) min. Levene方差齊性檢驗F=0.596，P=0.462，可以認(rèn)為兩樣本方差相等，進(jìn)行方差齊性檢驗時，t=-20.455， P≈0.000，認(rèn)為兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2.3抗壓強(qiáng)度測定實(shí)驗組(6.52±1.61) MPa，對照組在(2.08±0.70) MPa. Levene方差齊性檢驗F=0.393，P=0.548，可以認(rèn)為兩樣本方差相等，進(jìn)行方差齊性檢驗時，t=6.732， P≈0.000，結(jié)果兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2.4超微結(jié)構(gòu)分析掃描電鏡檢查發(fā)現(xiàn)試樣的表面均有顆粒狀晶體形成，較多微孔，分布均勻，直徑幾個至十幾個微米. 添加CS后，晶體仍然呈現(xiàn)顆粒狀，證明添加CS對水泥的固化反應(yīng)產(chǎn)物未形成影響. 只是顆粒間互相連接更加緊密，孔隙較對照組少（Fig 1）.

2.5肌肉植入試驗術(shù)后老鼠飲食、活動正常，傷口愈合良好. 大體觀察1 wk時有輕微炎癥反應(yīng)，4 wk后炎癥反應(yīng)消失，柱狀體包裹在肌肉內(nèi)，兩者間無纖維膜. 12 wk后實(shí)驗組質(zhì)地變軟，可見軟組織長入，對照組基本維持原來植入的形狀. 未見肌肉壞死.

2.6細(xì)胞種植掃描電鏡觀察細(xì)胞種植于材料表面3 d后，于表面貼附生長，呈多邊形. 實(shí)驗組材料表面的細(xì)胞數(shù)目多，細(xì)胞呈現(xiàn)團(tuán)塊生長，對照組的細(xì)胞數(shù)目少（Fig 2）.

3討論

CPC是20世紀(jì)80年代中期研制的自固化型、非陶瓷類羥基磷灰石（HA）類人工骨材料. 其固、液相按比例混合后，先形成一種可任意塑形的膏體，在室溫或者體內(nèi)環(huán)境下凝固可轉(zhuǎn)變成含微孔結(jié)構(gòu)的HA晶體. 理想的抗壓強(qiáng)度，適宜的凝結(jié)時間是CPC研究的一個重要方向. 理想的抗壓強(qiáng)度應(yīng)該介于皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨之間，適當(dāng)?shù)哪Y(jié)時間以利于手術(shù)進(jìn)行為原則，一般認(rèn)為5~20 min為宜. 隨著對CPC水合機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)原料成分、顆粒大小及匹配度、鈣磷比、晶種、固化液的量、溫度等等因素都能顯著影響CPC的水合反應(yīng)，進(jìn)而影響水泥的理化特性. 同時凝膠、膠原、藻酸鈉等添加劑也能改善CPC的性能，但是都不是很理想.我們利用CS作為CPC改性的添加劑，發(fā)現(xiàn)添加5%CS可以縮短凝結(jié)時間，提高抗壓強(qiáng)度. 分析原因可能是當(dāng)CPC與酸性殼聚糖溶液混合后，酸和鈣發(fā)生螯合反應(yīng)，很快凝固形成水凝膠，縮短初步凝結(jié)時間. CS由并列的H結(jié)合鏈組成，與天然骨的力學(xué)性能更接近，所以能提高復(fù)合物的力學(xué)性能，同時抗壓強(qiáng)度提高還可能與微孔結(jié)構(gòu)減少有關(guān).

生物骨替代材料如果不穩(wěn)定，接觸體液或血液后會發(fā)生潰散、遷移. 一方面會影響成骨，因為在骨愈合的初期植入材料的穩(wěn)定非常重要；另一方面可能損傷健康組織. 模擬生物材料(analogue biomaterials)概念的提出引發(fā)了生物活性微粒加聚合體基質(zhì)構(gòu)成仿生骨這一思路［9］. 生物活性成分促周圍組織生長，將組織和植入材料牢固結(jié)合，聚合體基質(zhì)則提供材料的柔韌性，限制顆粒的遷移. 我們利用殼聚糖作為基質(zhì)，改善CPC的粘結(jié)性能，限制CPC顆粒的移動，提高其臨床操作的柔順性、抗水沖刷能力. 隨著復(fù)合物在體內(nèi)降解，殼聚糖可為骨基質(zhì)合成提供氨基多糖原料. 當(dāng)然這僅僅是簡單材料組成的模仿，絕非是真正意義上的仿生.

CPCCS復(fù)合物生物相容性如何是進(jìn)行進(jìn)一步動物實(shí)驗前必須考慮的問題. 對生物材料相容性評價方法主要有兩類：一是動物體內(nèi)實(shí)驗，即將材料植入體內(nèi)，分階段將植入體與周圍組織取出，行組織學(xué)檢查，觀察材料及周圍組織病理變遷. 二是體外實(shí)驗，觀察材料或材料浸提液對組織細(xì)胞生長及代謝的影響［10，11］. 從理論上講，CPC水合過程中以及水合后的產(chǎn)物HA呈堿性；殼聚糖溶解于弱酸溶液內(nèi)，其代謝產(chǎn)物也呈酸性. 兩者可能正好中和［12］從而減輕因為非生理性pH值所引發(fā)的不良反應(yīng)，而且CS表面為親水基團(tuán)，可以有利于吸附血清或者體液內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞黏附及增殖. 短期肌肉植入試驗發(fā)現(xiàn)在固化體植入后，兩者局部有炎性反應(yīng)，植入?yún)^(qū)有炎性細(xì)胞浸潤，但是隨著觀察期延長，反應(yīng)減輕直至消失，說明炎性反應(yīng)在一定程度上是由手術(shù)創(chuàng)傷所致. 各時間段病理檢查未見肌肉壞死. 3 mo后實(shí)驗組軟化，可見大量軟組織長入，可能與CS的吸收有關(guān)，而對照組仍然是植入時的形狀. 要完成骨愈合，支架材料必須有利于成骨前體細(xì)胞遷徙、貼附、分化. 由于材料不透光，所以本實(shí)驗選用細(xì)胞種植掃描電鏡觀察的方法，發(fā)現(xiàn)成骨條件培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以在復(fù)合材料表面很好的生長. 從而證實(shí)材料無細(xì)胞毒性作用，適合成骨前體細(xì)胞的貼附、生長.

本研究初步顯示，CS可以改善自制CPC的理化及生物相容性. 復(fù)合材料的成骨性能如何還有待進(jìn)一步研究.

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篇8

——有機(jī)硅的生物相容性與安全性評價

生命是人們永恒探究的課題，在漫長的求索過程中生物醫(yī)用材料一直扮演著不可或缺的角色。有記載表明，早在古希臘時代人們就已經(jīng)開始用馬尾上的毛作為外科縫合線進(jìn)行一些外科手術(shù)。時至今日生物醫(yī)用材料已獲得長足的進(jìn)步，其中醫(yī)用高分子材料更是被譽(yù)為醫(yī)療技術(shù)發(fā)展史上的一次飛越。

在此我謹(jǐn)對醫(yī)用高分子材料中的有機(jī)硅材料談一些我個人的認(rèn)識。

1954年，mc dougall發(fā)現(xiàn)對外界影響極為敏感的熱血動物的各種細(xì)胞組織與液態(tài)、半液態(tài)和類似橡膠態(tài)的有機(jī)硅制品接觸時，其細(xì)胞組織的發(fā)育狀態(tài)未見異常，表明硅橡膠不會對細(xì)胞生長產(chǎn)生不良的影響。醫(yī)用硅橡膠的醫(yī)學(xué)特性就此被發(fā)現(xiàn)。隨后在20世紀(jì)60年代，國外開始將硅膠制品植入人體。心臟起搏器、人工心臟瓣膜等的應(yīng)用給不少患者帶來福音。到70年代，國外已有許多醫(yī)用硅橡膠制品（硅橡膠、指關(guān)節(jié)、眼眶底托、氣管插管、耳廓、腦積水引流管、腹膜透析管、帶氣囊分道導(dǎo)管、導(dǎo)尿管等）投入了臨床應(yīng)用。我國的發(fā)展雖然晚與外國，但在十幾年來也獲得長足進(jìn)展。目前我國的硅膠制品已涵蓋了腦外科，心胸外科，內(nèi)科，皮膚科，整形外科等諸多領(lǐng)域。因為生物醫(yī)用材料最基本的要求是它必須與生物系統(tǒng)直接結(jié)合,所以生物醫(yī)用材料都必須具備生物學(xué)性能,即生物相容性,這是生物醫(yī)用材料區(qū)別于其它功能材料的最重要的特征,并且要求這種材料不會因與生物系統(tǒng)直接結(jié)合而降低其效能與使用壽命。生物醫(yī)用材料與活體系統(tǒng)的相互作用表現(xiàn)在兩個方面:一是材料反應(yīng),即活體系統(tǒng)對材料的作用,包括生物環(huán)境對材料的腐蝕、磨損和性質(zhì)退化、甚至破壞。二是宿主反應(yīng),即材料對活體系統(tǒng)的作用,包括局部和全身反應(yīng),如炎癥、細(xì)胞毒性、凝血、過敏、致癌、畸形和免疫反應(yīng)等。其結(jié)果可能導(dǎo)致對機(jī)體的中毒和機(jī)體對材料的排斥。

接下來我們就選取有機(jī)硅的幾個具體應(yīng)用案例來對它的生物相容性及安全性進(jìn)行評價。

一 用一次性硅膠導(dǎo)尿管作引流管治療氣胸和胸腔積液

《中華實(shí)用醫(yī)藥雜志》20__ 年 6 月 第 5 卷 第 12 期

黑龍江省佳木斯市結(jié)核醫(yī)院對20例患者采用一次性硅膠導(dǎo)尿管進(jìn)行胸腔閉式引流術(shù)，肺復(fù)張較快無痛苦，引流全過程無脫落，引流管滯留時間3～15天，平均7天，引流通暢性良好，未見明顯不適反應(yīng)。

在上述病例中我們了解到硅膠導(dǎo)尿管在人體中滯留一段時間后患者并沒有出現(xiàn)明顯不適反應(yīng)，這說明硅膠制品無毒性并且具有較好的組織相容性。

二 使用硅膠管治療淚道阻塞

中國人民第264醫(yī)院

臨床資料

23例淚道阻塞患者，男性4例，均為單眼，共4只眼，女性19例，單眼14例，雙眼5例，共24只眼，總計28只眼。年齡18～53歲，平均42歲。病程1～15 a，平均5.6 a。

結(jié)果

23例中隨訪1 a者5例，0.5 a者1例，3個月以上者17例。拔管后23例28只眼中22只眼癥狀完全消失，占78.57%，2只眼癥狀明顯改善，占7.14%，4只眼雖癥狀改善，但仍主訴有較明顯的溢淚，占14.29%，這4只眼行2次插管，留置時間為2～4周，拔管后3個月再復(fù)查，溢淚癥狀均消失。

在上述病例中我們可以發(fā)現(xiàn)硅膠材料在人體內(nèi)停留了較長時間但患者并未產(chǎn)生不良反應(yīng)并且在材料取出后一段時間內(nèi)也未有不良癥狀產(chǎn)生。由此可見硅膠材料應(yīng)具有良好的生物相容性。

三 硅膠鞍鼻注射整形1014例五年隨訪分析

《生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)》 華西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院

本院用gn514室溫硫化硅橡膠作鞍鼻注射整形1014例,其中男性132例,女性882例,患者年齡由16歲至53歲,年齡存30歲以下者占800例。gn514硅膠為液態(tài),使用前為兩組份,即gn514—m和gn514—n.當(dāng)兩組份液體等量均勻混合后,經(jīng)30—60分鐘可硫化成為固體硅膠。從1979—1984年我們應(yīng)用gn514硅膠對1014例鞍鼻患者進(jìn)行注射整形,其中僅3例分別于注射后第4,7,12月發(fā)生局部炎癥反應(yīng)(不良反應(yīng)率為0.3％)。此3例經(jīng)手術(shù)刮除部份感染組織,作了組織病理學(xué)檢查,為局部慢性炎癥,但未發(fā)現(xiàn)癌變。

上述病例充分說明硅膠具有良好的組織相容性不良反應(yīng)率低。且在術(shù)后一年內(nèi)致癌可能性低。

四 假體

篇9

[關(guān)鍵詞] 海藻酸鈣； 納米羥磷灰石； 復(fù)合材料； 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞； 生物相容性

[中圖分類號] R 783.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.01.007

Preparation of sodium alginate-nanohydroxyapatite composite material for bone repair and its biocompatibility Wang Yanmei1， He Jiacai1，2， Li Quanli1，2， Shen Jijia3. （1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， Stomatological Hospital Affiliated to Anhui Medical University， Hefei 230032， China； 2. Key Discipline of Clinical Science of Stomatology in Anhui Province， Province Laboratory of Oral Diseases， Central and Local Working Together for the Oral Medical Center Labora-tory， Hefei 230032， China； 3. Dept. of Microbiology and Parasitology， Anhui Medical University， Hefei 230032， China）

[Abstract] Objective To prepare sodium alginate-nanohydroxyapatite composite material and to explore its feasibility as a bone repair material. Methods Sodium alginate-nanohydroxyapatite composite material was prepared using chemical cross-linking and freeze-drying technology. The composite was characterized by X-ray diffraction （XRD） and scanning electron microscope （SEM） and its porosity was measured by liquid displacement method. The fifth passage of bone marrow stromal stem cells （BMSCs） were incubated on the composite material and then growth was observed by inverted micros-cope and SEM. BMSCs were cultured with liquid extracts of the material， methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay was used to calculate the relative growth rate （RGR） on 1， 3， 5 d and to evaluate the cytotoxicity. Fresh dog blood was added into the liquid extracts to conduct hemolysis test， the spectrophotometer was used to determine the optical density （OD） ??and to calculate the hemolysis rate. Results Sodium alginate-nanohydroxyapatite composite material displayed porosity， the porous pore rate was （88.6±4.5）%. BMSCs showed full stretching and vigorous growth under inverted microscope and SEM. BMSCs cultured with liquid extracts of the material had good activities. The toxicity of composite material was graded as 1. Hemolysis test results showed that the hemolysis rate of the composite material was 1.28%， thus meeting the requirement of medical biomate-rials. Conclusion The composite material fabricated in this study has high porosity and good biocompatibility.

[Key words] sodium alginate； nanohydroxyapatite； com-

posite material； bone marrow stromal stem cells； biocom-patibility

創(chuàng)傷、感染、腫瘤等造成的骨缺損的修復(fù)是臨床醫(yī)學(xué)亟待解決的難題之一。在缺損區(qū)植入骨修復(fù)材料是解決上述問題的重要手段。人工材料是常用的骨修復(fù)材料，目前所用的主要是以鈦為代表的第一代生物惰性材料和以生物玻璃、磷酸鈣類陶瓷為代表的第二代生物活性材料。骨組織是由有機(jī)大分子和無機(jī)礦物組成的復(fù)合物，其中有機(jī)基質(zhì)主要是Ⅰ型膠原，但膠原具有一定的免疫原性和細(xì)胞毒性且降解速度不可控，因此其作為生物材料應(yīng)用于臨床受到一定限制[1-3]。海藻酸鈉（sodium alginate，ALG）是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取的一種碳水化合物，其分子中含有能與多種金屬離子（如Ca2+）反應(yīng)形成凝膠的羧基和羥基，它具有良好的生物相容性、生物降解性和可塑性，作為組織工程的載體材料能承載大量的細(xì)胞。羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）是人體骨組織的主要無機(jī)成分，具有良好的生物相容性和生物活性，能夠與骨組織形成生物鍵合，被廣泛地用于人體硬組織修復(fù)[4]；但是單純的HA脆性大、骨誘導(dǎo)作用弱、不易降解，限制了其應(yīng)用；因此，本實(shí)驗采用化學(xué)交聯(lián)及冷凍干燥技術(shù)將兩者結(jié)合，制備海藻酸鈣-納米羥磷灰石復(fù)合材料（composite material，CM），評價其生物相容性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗動物

選取由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心提供的比格犬為研究對象。實(shí)驗動物體質(zhì)量約10 kg，雌性。

1.2 主要試劑和儀器

ALG、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美國），納米HA（北京德科島金科技有限公司），硫酸鈣（北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）。冷凍干燥儀（LABCONCO公司，美國），掃描電鏡（scan-ning electron microscope，SEM）（FEI公司，美國），X線衍射儀（理學(xué)電機(jī)公司，日本），酶標(biāo)儀（BIOTEK公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 材料的制備與表征 分別稱取6 g ALG、6 g nHA粉末、2 g硫酸鈣，各加入100、100、200 mL雙蒸水中，配成6%ALG溶膠、6%nHA漿料、1%硫酸鈣漿料。上述過程在磁力攪拌下持續(xù)2 h。硫酸鈣漿料靜置24 h以上，用前攪拌5 min。然后在磁力攪拌下將nHA漿料緩慢加入ALG溶膠中，再次攪拌3 h，反應(yīng)過程中不斷調(diào)節(jié)pH值，使其始終保持在7.0～

8.0。將所得混合物低溫預(yù)凍8 h，冷凍干燥24 h即得ALG-nHA復(fù)合物。室溫下將硫酸鈣漿料緩慢加入ALG-nHA復(fù)合物中，抽真空交聯(lián)48 h后雙蒸水反復(fù)漂洗，再次冷凍干燥即得最終產(chǎn)物海藻酸鈣-納米羥磷灰復(fù)合材料。將所得材料采用X光衍射（X-ray diffraction，XRD）進(jìn)行物相結(jié)構(gòu)分析，液氮脆斷后斷面行SEM觀察。

1.3.2 孔隙率測量 采用液體置換法測定孔隙率[5]：量筒稱取V0體積的無水乙醇，將一定大小的材料完全浸入其中，抽真空約30 min，此時體積記為V1；將材料取出，剩余乙醇體積記為V2，計算支架孔隙率（P），公式為P=（V0-V2）/（ V1-V2）×100%，共測6個樣品，取其平均值。

1.3.3 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal stem cells，BMSCs）的分離培養(yǎng) 將實(shí)驗犬常規(guī)麻醉、備皮、消毒、鋪巾，于髂后上棘后下約1 cm骨質(zhì)較平處垂直穿刺，抽吸骨髓液5 mL，加入含肝素的離心管中。用5 mL DMEM混合上述骨髓液，常溫下以1 500 r·min-1 離心5 min。棄上清，培養(yǎng)基重懸后接種于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。3 d后首次換液，以后3～4 d換液1次。7～10 d待細(xì)胞融合至約80%時用胰酶消化后按1︰2的比例傳代接種。其后3 d傳代1次，選取生長良好的P3～P5細(xì)胞進(jìn)行下列實(shí)驗。

1.3.4 直接接觸實(shí)驗 將消毒后的材料制備成5 mm×5 mm×3 mm大小置于24孔板中，加適量培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)濕24 h。將細(xì)胞濃度為每毫升1×106個的P5細(xì)胞以每孔300 μL接種于材料上，孵育2 h后每孔再加2.5 mL培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。3 d換液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。第5天時用3%戊二醛4 ℃固定材料4 h，梯度乙醇脫水，真空干燥后行SEM觀察。

1.3.5 體外細(xì)胞毒性試驗 依據(jù)《ISO10993-5：2009醫(yī)療器械生物學(xué)評價第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗》進(jìn)行實(shí)驗。將材料按0.1 g·mL-1加入培養(yǎng)基中37 ℃浸提24 h，過濾除菌備用。P3細(xì)胞常規(guī)消化后制成濃度為每毫升2×104個的細(xì)胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔板常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)液，按照分組情況每孔分別加入培養(yǎng)基（A組）、浸提液（B組）、6.4%苯酚（C組）200 μL，每組8個復(fù)孔。分別于第1、3、5天取出培養(yǎng)板，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，然后進(jìn)行甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測操作，最后490 nm下酶標(biāo)儀測定各孔光密度（optical density，OD）值，并計算相對增殖率（relative growth rate，RGR），公式為：RGR=ODB組/ODA組×100%。根據(jù)RGR值評價細(xì)胞毒性[6]，評價標(biāo)準(zhǔn)如下。1）0級：RGR≥100%；2）1級：RGR為75%～99%；3）2級：RGR為50%～74%；4）3級：RGR為25%～49%；5）4級：RGR為1%～24%；6）5級：RGR為0。

1.3.6 溶血試驗 溶血試驗參照《ISO10993-4：2002醫(yī)療器械生物學(xué)評價第4部分：與血液相互作用試驗選擇》設(shè)計實(shí)驗。采集犬血2 mL與1 mL肝素混勻，加入2.5 mL生理鹽水稀釋備用。實(shí)驗分為浸提液組、生理鹽水組（陰性對照組）、雙蒸水組（陽性對照組）。每組5個平行樣本，每個樣本5 mL，每個樣本中加入0.1 mL備用血，37 ℃孵育1 h后2 500 r·min-1離心5 min，觀察樣本外觀。取上清液，分光光度計545 nm下檢測OD值，按公式計算溶血率：溶血率=（OD浸提液組-OD陰性對照組）/（OD陽性對照組-OD陰性對照組）×100%，溶血率

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，組間比較采用兩樣本t檢驗，P

2 結(jié)果

2.1 材料的形貌及孔隙率

SEM掃描結(jié)果顯示材料具有多孔性，孔徑和孔形態(tài)不一，且孔與孔之間有一定的貫通性，孔隙率高達(dá)（88.6±4.5）%，孔的存在有利于細(xì)胞的生長及引導(dǎo)新骨長入。材料無明顯的無機(jī)顆粒團(tuán)聚現(xiàn)象，僅在孔壁見少量的nHA附著（圖1）。

圖 1 復(fù)合材料的觀察結(jié)果 SEM × 2 000

Fig 1 Observation of CM SEM × 2 000

2.2 材料結(jié)晶度分析

ALG、CM及nHA的XRD圖譜見圖2。由圖2可見，ALG沒有尖銳狹窄的晶體峰，峰都較寬，意味著ALG的低結(jié)晶特征。CM的衍射圖中出現(xiàn)了HA的特征峰，分別在2θ=25.7°、31.7°、32.9°和34.0°處。但與nHA衍射譜相比，各個峰較彌散，強(qiáng)度較弱，表明nHA結(jié)晶度變低或晶體體積減小，這一特點(diǎn)與天然骨類似。而ALG的特征峰在CM中消失或不明顯，說明硫酸鈣和nHA的加入破壞了ALG原有的結(jié)晶性，使其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形狀態(tài)。此外，CM中還出現(xiàn)了硫酸鈣的特征峰，可能是未反應(yīng)完的殘存硫酸鈣。導(dǎo)致ALG、nHA結(jié)晶度降低的原因可能是ALG中的羥基與nHA中的羥基產(chǎn)生氫鍵連接。

圖 2 ALG、nHA及CM的X線衍射圖譜

Fig 2 XRD patterns of ALG， nHA and CM

2.3 BMSCs與CM共培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察

材料與BMSCs共培養(yǎng)5 d時在其周圍可見細(xì)胞附著，并伸展貼壁，細(xì)胞呈長梭形或多角形，密集區(qū)呈放射狀向周圍擴(kuò)展，細(xì)胞狀態(tài)良好（圖3左）。SEM下觀察可見，材料上附著了大量干細(xì)胞，細(xì)胞密度較高，呈梭形、多角形，伸出偽足并連接成片覆蓋在材料表面形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖3右）。

左：倒置顯微鏡 × 100；右：SEM × 250。

圖 3 BMSCs在材料上生長5 d的形態(tài)學(xué)觀察

Fig 3 Morphology of BMSCs attached to composite in fifth days

2.4 材料浸提液對BMSCs的毒性試驗

細(xì)胞與浸提液共培養(yǎng)1 d后，倒置顯微鏡下可見B組和A組BMSCs透亮，貼壁良好，多已充分伸展，形態(tài)正常，2組細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)無明顯差異，細(xì)胞間隙稍大（圖4）；C組細(xì)胞顏色變暗，部分細(xì)胞輪廓增粗，開始變圓皺縮，個別細(xì)胞飄浮（圖4）。各組OD值、RGR及毒性分級見表1。由表1可見，B組細(xì)胞毒性為1級，即材料基本無細(xì)胞毒性，符合生物材料的安全標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 溶血試驗結(jié)果

生理鹽水組和浸提液組離心后血細(xì)胞沉積于管底，上清液透亮接近無色；雙蒸水組顏色均一，呈淡紅色，無明顯血細(xì)胞沉積（圖5）。浸提液組、生理鹽水組和雙蒸水組OD值測定結(jié)果分別為0.014±0.008、0.003±0.001、0.865±0.009。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，生理鹽水組和浸提液組OD值間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>

0.05），而上述兩組與雙蒸水組OD值間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P

圖中從左至右分別是生理鹽水組、浸提液組、雙蒸水組。

圖 5 溶血試驗樣本大體觀

Fig 5 General observation of samples after hemolysis test

3 討論

人體硬組織修復(fù)材料按來源可分為3類：1）自體骨移植材料；2）異體骨移植材料；3）人工材料。自體骨作為骨修復(fù)材料的“金標(biāo)準(zhǔn)”可促進(jìn)骨的愈合并為受植區(qū)提供結(jié)構(gòu)上的支持，但是其來源有限且供區(qū)有一定的并發(fā)癥，如血腫、骨折、疼痛等。異體骨雖具有自體骨的一些優(yōu)點(diǎn)，但其存在免疫排斥反應(yīng)，并有感染人類免疫缺陷病毒和肝炎等病毒的風(fēng)險，而且制樣、處理和存貯成本較高，所以其臨床應(yīng)用受到很大的限制[7-8]。為了克服這些局限，人們開始研究可用作骨替代物的人工材料。本實(shí)驗制備的海藻酸鈣-納米羥磷灰石復(fù)合材料即屬于人工合成無機(jī)/高分子材料，它具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）水溶性ALG的加入可以提高材料的親水性；2）ALG與鈣離子交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對nHA材料起增強(qiáng)增韌作用；3）ALG中的羥基與nHA的羥基鍵合，不僅可以增加有機(jī)相和無機(jī)相之間的結(jié)合力，使得nHA粒子更穩(wěn)定地分散于有機(jī)相中，還降低了nHA的結(jié)晶度，CM與人體骨結(jié)構(gòu)更接近，生物活性增加。

生物材料不僅要滿足臨床應(yīng)用時所需的理化性能，還需有良好的生物相容性，確保其臨床應(yīng)用的有效性和安全性。細(xì)胞培養(yǎng)法是檢測材料生物相容性的重要手段之一，它可直接觀察細(xì)胞與材料的復(fù)合生長情況，且操作相對簡單，可控性強(qiáng)。BMSCs具有自我復(fù)制、高度增殖和多向分化潛能，在特定條件下可向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等間葉組織細(xì)胞分化[9]。此外，BMSCs取材容易，體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，易定向分化，植入體內(nèi)后能很好地適應(yīng)受區(qū)生理、病理和應(yīng)力環(huán)境并保持成骨活性[10]，因此，它成為最具應(yīng)用前景的種子細(xì)胞。本實(shí)驗將BMSCs直接接種到CM上進(jìn)行體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡及SEM觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在材料周圍及表面附著良好，伸展充分，初步表明該材料有較好的生物相容性，符合生物材料應(yīng)用的基本要求。細(xì)胞毒性試驗結(jié)果顯示BMSCs的增殖活性基本未受影響，無細(xì)胞毒性反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了材料具有良好的生物相容性，無潛在毒性。溶血試驗結(jié)果也證實(shí)了上述結(jié)論。因此，該材料有望成為一種理想的骨替代材料。

海藻酸鈣-納米羥磷灰石復(fù)合材料修復(fù)骨缺損的理念主要是人體硬組織缺損的永久替代和功能恢復(fù)，它不能向活體組織一樣隨生理負(fù)荷、生化刺激作出相應(yīng)反應(yīng)，其生物活性仍有待提高。Hench等[11]提出構(gòu)建第三代生物材料：即把生物材料的“可吸收性”和“生物活性”結(jié)合，從替代生物組織的修復(fù)理念轉(zhuǎn)向主動誘導(dǎo)、激發(fā)組織器官再生。這一新的理念的提出必將為骨修復(fù)材料的研究帶來新的希望。

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篇10

［關(guān)鍵詞］抗菌不銹鋼;口腔醫(yī)學(xué);感染

不銹鋼材料因其具有良好的剛性、加工成型性、耐腐蝕性以及生物相容性，并且價格低廉，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器械及人體植入材料。在口腔醫(yī)學(xué)中，不銹鋼材料可用來制作正畸托槽、弓絲和微種植體，義齒支架、卡環(huán)，頜骨夾板等?？谇皇嵌喾N微生物共同定植的復(fù)雜環(huán)境，不銹鋼材料在口腔中的存在可能改變局部微生態(tài)構(gòu)成，使口腔致病菌增多或毒力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致感染性疾病的發(fā)生?？咕讳P鋼是近年來研究發(fā)展的一類新型材料，通過在不銹鋼中添加抗菌元素，使其既可作為結(jié)構(gòu)材料，又具備功能材料的抗菌作用，因此被廣泛應(yīng)用于公共保健設(shè)施、食品加工設(shè)備、醫(yī)療器械及其他衛(wèi)生敏感領(lǐng)域?？咕讳P鋼具有廣譜抗菌、抗菌時效長、不產(chǎn)生耐藥性以及生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，大大拓展了醫(yī)用不銹鋼的臨床應(yīng)用范圍。本文將就抗菌不銹鋼在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展及應(yīng)用作一綜述。

1抗菌不銹鋼概述

1.1抗菌不銹鋼的抗菌原理

抗菌不銹鋼的抗菌性能來源于其加入的抗菌物質(zhì)，如抗菌劑、光催化劑及抗菌金屬元素。研究表明，金屬離子都具有不同程度的抗菌能力，綜合安全性考慮，學(xué)者們認(rèn)為銀的抗菌效果最好，其次是銅和鋅［1］。目前金屬離子抗菌的原理尚不完全清楚，普遍接受的抗菌機(jī)理為“接觸式殺滅”［2，3］，即細(xì)胞接觸金屬離子后死亡。Ag+、Cu2+等金屬離子在有氧的情況下可催化相關(guān)反應(yīng)產(chǎn)生活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)。ROS的作用對象是細(xì)胞存活所必需的基本成份，如細(xì)胞膜蛋白、脂類，尤其是細(xì)胞膜磷脂中的不飽和脂肪酸。以銅為例，Cu2+從金屬析出后與細(xì)菌直接接觸，最先引起細(xì)胞膜損傷，使細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞膜電位消失，細(xì)胞呼吸停止，同時細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞內(nèi)容物外泄;隨即Cu2+進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，使酶類等蛋白質(zhì)變性，甚至DNA降解，從而損傷細(xì)胞的正常組成及其功能，達(dá)到抑制細(xì)菌生長繁殖或消滅細(xì)菌的目的。

1.2抗菌不銹鋼的種類

根據(jù)抗菌物質(zhì)或抗菌相在不銹鋼材料中的分布，抗菌不銹鋼可分為涂層型及合金型。涂層型抗菌不銹鋼是指以不銹鋼為基體，通過噴涂、離子注入、溶膠-凝膠等工藝將具有抗菌功能的材料涂覆于不銹鋼表面，如表面涂氟、洗必泰、Ti、Ag等［4］。涂層型抗菌不銹鋼的缺點(diǎn)是其抗菌性可能隨著抗菌涂層的磨損和剝脫而衰退。合金型抗菌不銹鋼是指在不銹鋼材料中添加抗菌金屬元素，一般添加Cu、Ag，經(jīng)過特殊熱處理使不銹鋼表面與內(nèi)部均勻分布著抗菌相。相比涂層型抗菌不銹鋼，合金型抗菌不銹鋼具有穩(wěn)定且持久的抗菌性能?？咕讳P鋼還可根據(jù)不銹鋼所含抗菌金屬元素來分類，如含銀、含銅抗菌不銹鋼。Ag+具有很強(qiáng)的抗菌性能，其抗菌活性是Cu2+的100倍、Ni2+的800倍，少量的銀即可發(fā)揮出優(yōu)良的抗菌效果，具有廣譜抗菌性，并且?guī)缀醪划a(chǎn)生耐藥性。但由于銀的價格較貴，目前研究及應(yīng)用較多的是含銅抗菌不銹鋼。銅是人體必不可少的微量元素，作為許多金屬蛋白和酶類的輔助因子參與多種生理和代謝過程，適量銅元素的添加能賦予不銹鋼材料強(qiáng)烈而廣譜的殺菌功能，且生物相容性良好，對材料的力學(xué)性能、加工性能及抗腐蝕性等幾乎沒有影響。

2抗菌不銹鋼在口腔醫(yī)學(xué)中的研究與應(yīng)用

2.1抗菌不銹鋼應(yīng)用于正畸矯治

正畸矯治用托槽、弓絲、帶環(huán)、微種植體以及絕大多數(shù)附件均由不銹鋼材料制成。固定矯治裝置在口腔中的存在，使局部微生態(tài)環(huán)境改變，口腔致病菌大量增殖，從而導(dǎo)致牙釉質(zhì)脫礦、齲病、牙齦炎及種植體周圍炎等疾病的發(fā)生。為此，學(xué)者們致力于開發(fā)具有抗菌性能的固定矯治用不銹鋼材料。2.1．1載Ag涂層抗菌不銹鋼固定矯治最常見的細(xì)菌源性不良反應(yīng)為牙釉質(zhì)脫礦。在不采取任何預(yù)防措施的情況下，牙釉質(zhì)脫礦的發(fā)病率高達(dá)80%以上。研究顯示，變形鏈球菌(Streptococcusmutans)、乳桿菌、放線菌等與牙釉質(zhì)脫礦有關(guān)，其中S．mutans是最重要的致齲菌。另外，固定矯治附件使牙周致病菌更容易在齦緣處堆積，引發(fā)牙齦炎、種植體周圍炎等。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingi-valis)作為一種證據(jù)充分的牙周致病菌，是牙齦炎、種植體周圍炎的優(yōu)勢菌。研究證實(shí)，添加銀離子的正畸矯治用不銹鋼材料可有效抑制口腔致病菌的生長。有學(xué)者的體外實(shí)驗證明鍍Ag涂層不銹鋼托槽對S．mutans具有強(qiáng)抗菌性［6-7］。Mhaske的體外研究顯示，鍍Ag涂層不銹鋼弓絲對嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophi-lus)有明顯的抗黏附性和抗菌性［8］。Metin-Gürsoy等［9］進(jìn)一步證實(shí)，納米銀涂層的不銹鋼托槽在動物模型中可有效抑制S．mutans的生長并降低平滑面齲的發(fā)生。Morita的體外研究分別檢測了鍍銀涂層正畸固定保持器對S．mutans和遠(yuǎn)緣鏈球菌(S．sobrinus)2種致齲菌以及P．gingivalis、中間普式菌(Prevotellain-termedia)、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)3種牙周致病菌的抗菌性能，在徑向擴(kuò)散實(shí)驗中，所有鍍銀涂層組周圍2mm內(nèi)均無細(xì)菌生長［10］。2.1．2光催化活性抗菌不銹鋼光催化抗菌材料主要為N型半導(dǎo)體材料，最常見的是TiO2型光催化劑，其在光照作用下會產(chǎn)生電子空穴，表面的空穴與吸附的水分子及氫氧根離子生成具有強(qiáng)氧化能力的羥基自由基(•OH)，分解細(xì)菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂類，使細(xì)菌失去活性死亡，達(dá)到抗菌目的。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在正畸弓絲表面覆蓋一層TiO2后可以有效的抗S．mutans和P．gingivalis黏附［11］。Shah等［12］也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TiO2表面改性的不銹鋼托槽對L．a(chǎn)cidophilus有較強(qiáng)的抗黏附和抑制生長作用。張晟等［13］進(jìn)一步通過載入具有光學(xué)誘導(dǎo)還原作用的貴金屬Ag作為納米TiO2的活性劑，提高了納米TiO2的光催化性能，使納米Ag/TiO2涂層托槽在微弱光甚至無光照條件下同樣產(chǎn)生抗P．gingivalis的效果，并且證明納米Ag/TiO2能夠降低P．gingivalis重要毒力因子———牙齦素的活性，其可能的機(jī)制為納米TiO2產(chǎn)生的強(qiáng)氧化性自由基干擾牙齦素蛋白酶的合成及納米Ag與牙齦素的巰基結(jié)合進(jìn)而使牙齦素失活。2.1．3含Cu抗菌不銹鋼微型支抗釘目前使用的支抗釘材料一般為純鈦、鈦合金及不銹鋼。鈦的骨結(jié)合能力強(qiáng)，但其材質(zhì)較脆易折斷，且價格較高。不銹鋼具有良好的延展性和強(qiáng)度，可抵抗一定程度的旋轉(zhuǎn)力，降低微型支抗釘折斷的風(fēng)險。學(xué)者已證實(shí)，不銹鋼合金與鈦合金具有相近的組織相容性和穩(wěn)定性［14-15］。但微型不銹鋼支抗釘脫落率較高，種植體周圍炎是主要的影響因素之一［16］。因此開發(fā)抗菌不銹鋼微型支抗釘具有重要的臨床意義。張丹等［17-18］評估了含銅不銹鋼(304-Cu、316L-Cu)體外抗P．gingivalis的能力及細(xì)胞毒性，結(jié)果表明含銅不銹鋼與不含銅醫(yī)用304不銹鋼相比，前者對P．gingivalis有更強(qiáng)的抗菌性，并且二者的細(xì)胞毒性無顯著差異。有學(xué)者將醫(yī)用純鈦、醫(yī)用不銹鋼和含銅抗菌不銹鋼分別與人骨肉瘤細(xì)胞共培養(yǎng)120h，根據(jù)5級毒性評價標(biāo)準(zhǔn)對各組細(xì)胞毒性進(jìn)行評價，結(jié)果顯示三者的細(xì)胞毒性等級均為0級［19］。徐璐［20］等證明316L-Cu不銹鋼有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附及增殖，并有效降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的早期凋亡率。Li等的研究顯示，316L-Cu不銹鋼較傳統(tǒng)不含銅316L不銹鋼可通過抑制TNF-α、IL-1β等炎癥因子，從而減少白細(xì)胞的招募、浸潤，降低血管支架植入后的炎癥反應(yīng)［21］。以上結(jié)果提示，含銅不銹鋼具有較好的生物相容性，可作為傳統(tǒng)不銹鋼微型支抗釘?shù)奶娲牧希哂辛己玫膽?yīng)用前景。

2.2抗菌不銹鋼應(yīng)用于口腔頜面外科

不銹鋼材料在口腔頜面外科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用也較為廣泛，例如正頜手術(shù)、唇腭裂修復(fù)手術(shù)及骨折固定用克氏針、夾板等。Liu等［22-23］研究顯示，納米銀顆粒和聚乳酸-羥基乙酸共聚物共涂層的不銹鋼植入體在感染的大鼠股骨腔中可有效抑制金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，同時可誘導(dǎo)骨的形成。其機(jī)制可能是通過促進(jìn)人類骨髓基質(zhì)干細(xì)胞遷移、啟動ERK1/2信號并上調(diào)成骨性相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)成骨向分化。銅也是研究較廣泛的抗菌及骨誘導(dǎo)元素。有學(xué)者在模擬體液實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，隨著Cu2+的釋放，316L-Cu不銹鋼可有效抑制大腸桿菌生長［24，25］。銅離子還可以刺激機(jī)體細(xì)胞釋放多種生長因子，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及鈣鹽的沉積［26］。有學(xué)者研究表明，317L-Cu不銹鋼同樣具有良好的生物相容性并對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抗菌性，且具有比鈦合金更強(qiáng)的成骨能力［27-28］。Wang等［29］通過體內(nèi)外實(shí)驗證明，317L-Cu不銹鋼在早期階段，Cu2+通過促進(jìn)TNF-α的分泌從而調(diào)節(jié)NF-κB信號通路和Caspase3，引起植入物周圍的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡;但隨著組織的愈合，炎癥反應(yīng)和凋亡顯著降低，提示317L-Cu不銹鋼異物反應(yīng)較小。鎂基金屬在人體內(nèi)降解會引起周圍環(huán)境的堿性增加，從而破壞細(xì)菌的生存條件，起到殺菌的作用。Robinson，楊柯等［30-31］學(xué)者均證實(shí)鎂基金屬在體內(nèi)可以殺死大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見感染細(xì)菌。Sutsha等［32］通過體外實(shí)驗，綜合考慮抗菌性和生物相容性后得出，含2mol%鎂的羥基磷灰石/甲殼素共涂層316L不銹鋼具有強(qiáng)抗菌性，革蘭陽性菌(如金黃色葡萄球菌)對鎂含量的增加更為敏感。Sutsha等［33］還發(fā)現(xiàn)，羥基磷灰石/甲殼素共涂層316L不銹鋼隨著表面硅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的能力增強(qiáng)，且當(dāng)硅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時，表面活性最佳，可誘導(dǎo)類骨樣羥基磷灰石層的形成。

3展望